[发明专利]转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌及其应用，按照转基因方法把来自枯草杆菌的淀粉酶基因转入到猪消化道瘤胃乳杆菌中，转基因的瘤胃乳酸杆菌转入猪胃肠道可在猪的胃肠道中大量繁殖，不仅起到微生态制剂的益生抑菌作用，而且又可分泌大量的淀粉酶，从而维持猪消化道内微生物平衡、抑制有害菌的生长、减少腹泻等消化道疾病发生，所产生的大量淀粉酶弥补了仔猪消化道结构不完善及分泌淀粉酶能力较弱的缺陷，提高了饲料中营养物质的消化率，达到了促进猪生长的目的。

主权项

1、转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌，其特征在于，把来自枯草杆菌的淀粉酶基因转入到猪消化道瘤胃乳杆菌中，其制备步骤如下：(1)、制备枯草杆菌(Bacillus subtilis)的菌体DNA作为模板，(2)、根据其基因文库中的淀粉酶基因的碱基序列，设计引物：正链为5’-TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA；负链为5’-CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。(3)、对淀粉酶基因进行PCR扩增反应，提取和纯化PCR产物。(4)、利用Hind III和Xba I两种核酸内切酶，分别处理可在大肠杆菌和乳酸杆菌中表达的质粒(PHMSXD1)和PCR扩增的α-淀粉酶基因，分离质粒和淀粉酶基因后，用QIAEX II纯化质粒和DNA片段。(5)、利用T4DNA连接酶把质粒(PHMSXD1)与淀粉酶基因连起来，构建出一个新的质粒载体(PHMSXD2)。(6)、乳酸杆菌感受态细胞的准备：瘤胃乳酸杆菌厌氧培养后，稀释，离心，洗涤，定容。(7)、转基因操作：感受态细胞与质粒载体混合移入到电击槽内，利用高压电击法，把质粒载体转入到瘤胃乳酸杆菌中。(8)、转基因处理后的乳酸杆菌，加入培养液静止培养，然后涂抹到含有淀粉和氨苄青霉素的MRS平皿上，厌氧培养。(9)、菌落出现后，原位复制菌落，从复制菌落中挑选阳性菌落，在含有淀粉的MRS厌氧培养液中培养后即得产物。