[发明专利]一种海绵原细胞的分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种海绵干细胞——原细胞的分离纯化方法，通过差速离心、细胞特异性聚集、差速黏附和密度梯度离心四种方法联用，提高了海绵原细胞分离纯化的纯度和效率，为研究繁茂膜海绵干细胞的生物学特性及体外培养规律提供了一种有效的原细胞制备方法。

主权项

1.一种海绵原细胞的分离纯化方法，其特征在于：可按如下步骤操作：(1)混合海绵细胞的制备：取新鲜洁净的健康海绵组织块，切割成1-10mm3 小块，振荡离散出海绵细胞，用200～500目筛网过滤，离心，留细胞沉定用含EDTA的CMFSW重悬即为混合海绵细胞；(2)差速离心：将混合海绵细胞悬液进行低速离心，300～800rpm，10～30min，留取细胞沉淀，弃去上清；(3)差速聚集：将差速离心获得的细胞接种于CMFSW中，使海绵细胞自由聚集形成细胞聚集体，弃去未参与聚集的游离细胞；(4)差速黏附：将细胞聚集体于人工海水中进行培养，细胞聚集体贴壁，海绵细胞聚集体贴壁铺展达最大程度后，用CMFSW洗去ASW，镜下观测应用含1～10mM EDTA的CMFSW先将原细胞离散下来，取出原细胞离散液，并震荡进行充分离散；(5)密度梯度离心：配制密度梯度液，用2-5％的Ficoll和20-40％泛影葡胺配制密度从1.01-1.10g/ml的梯度液，将步骤(4)所得细胞悬液铺于梯度液上，于500-2000rpm，离心10～30min，将各层细胞用滴管逐层取出，镜下观察，收集原细胞。