[发明专利]一种抗醛糖还原酶蛋白单克隆抗体的制备与鉴定方法

摘要

抗醛糖还原酶蛋白“AR”单克隆抗体的制备与鉴定方法产生的抗AR单克隆抗体分别高度特异抗AR抗原的不同区段；产生的抗AR单克隆抗体可以作为一种新的肝癌早期诊断辅助试剂：联合应用抗AR单克隆抗体和抗醛糖还原酶相似蛋白“ARL－1”单克隆抗体，可能找到一个新的、特异性高的肝癌早期诊断指标，将有助于肝癌的早期诊断，从而提高肝癌的生存率，改善其预后。经鉴定，由纯化ARB3、AR7B3G4、ARF10细胞株的培养上清而得到的三株抗AR单克隆抗体，Ig亚类均为IgG1，轻链属于κ型；均抗GST－AR，并与胎盘组织中的AR蛋白反应，且分别识别AR第1～79氨基酸、第111～142氨基酸、第143～316氨基酸位置，而与GST－ARL、GST、表达菌液蛋白无交叉反应。

主权项

1.一种抗醛糖还原酶“AR”单克隆抗体的制备方法，其特征在于该方法为：①从正常人胎盘组织提取总RNA；②根据已知AR序列，并使用“clustalx、antheprot”软件得到AR的抗原性分区、以及AR与醛糖还原酶相似蛋白“ARL-1”的序列比对同源性分区，针对AR全长、以及分别命名为dAR、dA1、dA2、dA3、dA4的五段截短部分设计六对引物，上游引物均含EcoR I酶切位点gc gaa ttc，下游引物均含NotI酶切位点gc ggc cgc；③通过逆转录聚合酶链式反应“RT-PCR”获得AR全长及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因；④采用基因重组手段，将以上获得的AR全长及dAR、dA1、dA2、dA3、dA4五段截短基因，共六段基因分别插入表达载体pGEX-4T-1(His)6C，将重组质粒转化入E.coli Rosetta，诱导表达AR全长及截短蛋白，获得GST-AR蛋白及GST-dAR、GST-dA1、GST-dA2、GST-dA3、GST-dA4截短蛋白；⑤采用杂交瘤技术制备抗AR单克隆抗体：将纯化的全长醛糖还原酶蛋白—谷光甘肽转移酶“GST-AR”重组蛋白免疫“Balb/c”小鼠，制备脾细胞悬液，在聚乙二醇“PEG”作用下与处于对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，将融合细胞培养于含次黄嘌呤-氨甲喋呤-胸腺嘧啶“HAT”的培养基；利用纯化的GST-AR蛋白包被酶标板，同时GST包被酶标板作为对照，根据方阵滴定结果，AR按1∶5000包被，GST按1∶3000包被，包被量均为100ng/孔；将待测的每一个杂交瘤集落孔的培养上清同时等量加入包被GST-AR和包被GST的酶标板孔，同时在GST-AR和GST包被系统分别设三孔为对照，一孔加新鲜细胞培养液作为空白对照，另一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul免疫小鼠的血清作为阳性对照(P)，还有一孔在新鲜细胞培养液中加入1ul正常小鼠的血清作为阴性对照(N)，采用间接酶联免疫吸附实验“ELISA”法进行检测，TMB底物显色，测定OD450值；P/N≥2.1，表示包被系统有效，GST-AR阳性(P1)，同时GST阴性(N1)，P1/N1≥2.1者为阳性，阳性对应的原细胞培养孔用有限稀释法亚克隆2～3次，至100％培养孔阳性，扩大培养，建立稳定分泌抗AR蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，获得三株能稳定分泌抗AR单克隆抗体的细胞株，分别命名为ARB3、AR7B3G4、ARF10；将细胞培养在含20％新生牛血清“FCS”的RPMI1640培养液中，收集细胞培养上清，纯化上清得到三株抗醛糖还原酶单克隆抗体。