[发明专利]一种柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法

摘要

本发明公开了一种柑橘再生和遗传转化的方法，其包括如下步骤：(1)种子消毒和萌发，进行将种子在酒精、升汞溶液中浸泡消毒后，再用无菌水冲洗，然后播种于培养基上培养，获得无菌苗；(2)对照材料芽的诱导，以MS培养基作为基本培养基，外加生长调节剂进行培养；(3)外植体转化处理，用农杆菌(携带目的基因)浸染无菌苗节间茎段(上胚轴)；(4)抗性芽的诱导；(5)不定芽微芽嫁接成苗；(6)温室二次嫁接。本发明的优点是：种子消毒效果好，几乎无污染；再生效率高，不定芽诱导率高达95％；共培培养基和筛选培养基能适合多品种和多种类型基因的遗传转化。

主权项

1、一种柑橘节间茎段再生和遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)种子消毒和萌发将普通溆浦甜橙或大红甜橙或柚或柠檬或枳橙种子从果实中取出后，剥去外种皮和约2/3的内种皮，在70％酒精中浸泡28-32s，0.1％的升汞溶液中浸泡8～12min，最后用无菌水冲洗3～4次，播种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基上，25～28℃暗培养18～24天，然后转入光照培养6-8天，获得无菌苗；(2)对照材料芽的诱导将28-32天的实生苗节间茎段上胚轴切成长约1～1.5cm，不经过农杆菌浸染直接进行不定芽的诱导，以MS培养基作为基本培养基，外加生长调节剂6-BA 1～5mg·L-1进行培养，培养温度26～28℃，光照强度1200lx～1600lx，光照时间每天10-14h；(3)外植体转化处理将携带目的基因之农杆菌划线培养在含有100mg·L-1卡那霉素的YEB培养基上，26-30℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，26-30℃振荡培养20～25h，达到菌对数生长期，OD260 ＝0.8～1.0，然后以4500-5500r/min离心8-12min，除去上清液，再用悬浮液悬浮即可用于感染；将28-32天左右的实生苗上胚轴切成长约1～1.5cm，浸入到农杆菌悬浮液中18-22min，随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液；(4)抗性芽的诱导将处理过的外植体接种在共培培养基：MS+BA 3mg·L-1 培养基上共培养2.5-3.5天后，转至筛选培养基MS+BA 1～5mg·L-1+Cef480-520mg·L-1+Km 50～100mg·L-1As0～20mg·L-1进行选择培养，诱导抗性芽的产生。培养温度26～28℃，光照强度1200lx～1600lx，光照时间每天12-14h；(5)不定芽微芽嫁接成苗卡里佐枳橙种子，先用70％的酒精浸泡30-45s，再用0.1％的升汞浸泡6min-8min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MT固体培养基上，在26℃-28℃黑暗条件下恒温培养12-16天(黄化苗)，用作砧木；在无菌条件下，将培养的黄化苗切去根端部留4.5cm-5.5cm长，切去茎上部留1.6-2.4cm长，顶端劈口；接着，剥取抗性芽，基部斜切，插在砧木的劈口处，置于MS+10ml white有机物(25mg·L-1烟酸+25mg·L-1VB6+5mg·L-1VB1)+75g·L-1蔗糖+100mg·L-1肌醇)液体培养基中光照培养；(6)温室二次嫁接待芽子长到1.6cm-2.4cm，进行温室二次嫁接，二次嫁接以枳壳为砧木，采用劈接法，内套一塑料袋，用脱脂棉吸水置于袋内，以保持袋内湿度，外套一纸袋遮光，待成活后逐渐去除套袋。