[发明专利]人异体间质干细胞（携带治疗基因）的大规模培养新工艺

摘要

本发明公开了一种人异体间质干细胞被用于基因治疗载体的商业化培养工艺，解决了人异体间质干细胞(携带治疗基因)从实验室制备到工业化生产过程中的一系列难题，特别是采用发酵罐和转瓶的生产工艺，使产量得到大幅提升，降低了生产成本，满足了临床商业化的要求；其次，是采用无血清生产工艺，克服和杜绝了动物血清对产品的污染问题。本发明的生产工艺过程包括：人异体间质干细胞(携带治疗基因的种子细胞)的生产培养；治疗基因的转染和导入(质粒DNA、RNA分子、病毒载体如AV、AAV等以及非病毒载体)；细胞的收集和纯化；安全性和生物活性检测后包装储存。该生产工艺具有可控性和可操作性，保证了间质干细胞的生物活性，有很高的生产效益。

主权项

1.人异体间质干细胞(携带治疗基因的种子细胞)在GMP条件下大规模培养新工艺，其创新性包括以下几个重要生产工艺的改进和创新：发酵罐悬浮培养技术；无血清培养工艺；治疗基因的转染技术(质粒DNA、RNA分子、病毒载体和非病毒载体)；携带治疗基因的间质干细胞的大量富集。具体生产工艺步骤如下：(1).人异体间质干细胞(携带治疗基因)种子的来源和建立取自引产胎儿的骨髓间质干细胞(选择前应对抽取者母体做安全性要求的检测如：HIV，乙肝，丙肝，梅毒，衣支原体，遗传病，以及详细地采集病史，排除不健康的诸多因素，证明键康和安全的引产儿)或胎盘，脐血，成体骨髓间质干细胞。携带治疗基因的种子人异体间质干细胞的建立，分两步进行：从原代细胞开始转染治疗基因，取已转染治疗基因的细胞作种子细胞进行传代培养至5-8代左右细胞(细胞传代培养中观察到，第10代的细胞增殖能力最强，细胞繁殖最旺盛)，达到生产量后，收集细胞；从原代细胞开始传代培养(不转染治疗基因)，传代培养至5-8代左右细胞分别存入种子工作库，备作大规模生产培养的工作种子。(2).人异体间质干细胞的放大(生产化)培养用50L的特殊专用发酵罐，将人异体间质干细胞工作细胞库中的种子细胞复苏、传代，按25L的发酵培养用量，接种1.5×105/mL的接种量，接种人异体间质干细胞入罐，接种前先预热发酵罐至37℃，用CO2校正和平衡培养基pH值。按间质干细胞的培养生长条件，采用无血清或血清的培养介质，进行间质干细胞发酵罐悬浮培养方法进行生产化扩增培养，为保持间质干细胞不分化，培养基中绝不能加入有促进间质干细胞分化潜能的细胞因子和细胞生长因子，只能加入使细胞保持在未分化状态增殖的细胞因子和细胞生长因子。发酵罐培养过程中的各项间质干细胞培养生长条件的参数，由发酵罐的计算机程控自控检测。培养过程中程控所显示的培养参数变化，应立即予以补充(特别是细胞培养生长过程中对介质的要求和代谢产物清除)必须及时给予满足，使罐内的细胞生产在最佳状况。细胞的悬浮培养过程中，搅拌的速度约100-300r/min，不得大于350r/min，叶轮的切片应光滑，不能有锋尖的棱角在搅拌时损伤细胞。搅拌的目的是保持细胞均匀呈悬浮状态生长，保持罐内立面的细胞均能得到所需的代谢物(如：氧，氨基酸，糖原，核酸等)和排除代谢的废物，使细胞保持三维空间最佳生长状态。当细胞增殖至罐内有效培养面积的80％时，进行下阶段治疗基因的转染过程。(3).人间质干细胞与治疗基因载体共转染培养人间质干细胞作于载体的靶细胞在发酵罐中大量扩增培养，至罐内培养密度的80％左右，将目的基因(质粒DNA、RNA分子、病毒载体和非病毒载体)加入发酵罐中进行基因转染，如果是转染质粒DNA或RNA分子，技术相对简单，(转染时加氯化钙其它物质以增加细胞膜的通透性，使细胞膜空隙增大，易于吸入质粒DNA到细胞内)，但转染率不高。用病毒载体进行转染的过程比较复杂，特别是本发明着重推荐的腺相关病毒载体(rAAV)进行转染。值得一提的是间质干细胞在发酵罐中培养的基本条件，应尽量提供与体内生活条件相接近的培养环境，培养环境至少包括以下几个因素：所有与细胞接触的设备，器材，溶液等，其中包括种子库细胞培养和放大培养及生产过程，都必须保持绝对无菌，避免细胞受微生物的污染；必须要有充足的营养供应，绝对不能含有有害物质，甚至极微量有害离子；保证有适量的氧气供应；及时清除细胞代谢产生的有害物质；有良好的适于细胞生存的外界环境，包括渗透压，离子密度，氨基酸浓度，氧分压，二氧化碳分压，葡萄糖浓度，pH值，氨浓度等，以及保持合适的细胞密度。(4).人间质干细胞(携带治疗基因)的收集间质干细胞经目的基因(质粒DNA、RNA分子、病毒载体或非病毒载体)转染后，利用反应器(发酵罐)的滤膜排放系统将培养混合液滤放掉，排放去占发酵罐总体积约90％的培养液，留下大约5L的细胞混合液，在洗脱液的洗脱下，将细胞和洗脱液一起经过离心或过滤，收集沉淀的细胞层；等测试细胞冻存制品的安全性和细胞生物活性后，分别罐装入西林瓶中，贴上标签，再存入液氮中保存，分装时的细胞(携带治疗基因)加入适量的冰冻保护液以保证细胞在冰冻中不易破坏，保持细胞的生物活性。在销售到临床使用整个过程也应做到液氮低温运送条件，使产品在临床使用时，始终保持最佳的生物活性。