[发明专利]一种单管一步三引物反转录聚合酶链反应方法

摘要

一种单管一步三引物反转录聚合酶链式反应方法，其RT－PCR反应液含一对PCR引物和一个位置在PCR反引物下游的反转录引物，PCR引物被包埋在石蜡等固体颗粒内置于反应液中，反转录时不与反应液接触，进入扩增阶段石蜡熔化引物被释放到溶液中。同时通过设计PCR引物的解链温度大于反转录引物的解链温度、目标扩增产物的解链温度低于由PCR正引物与反转录引物形成的非目标扩增产物的解链温度、或设计反转录引物位置距PCR反引物较远等方法避免反转录引物对扩增的干扰。适用于终点法直接荧光或闭管直接荧光方法进行高速度、高通量的RNA检测。

主权项

1，一种单管一步三引物反转录聚合酶链式反应方法，反应液组成包含反转录酶、耐热DNA聚合酶、一个基因專一反转录引物和一对在反轉錄引物上游的PCR引物，反应依次包括如下步骤：(1)由RNA反转录合成cDNA；(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行扩增反应；其特征在于一对PCR引物在反轉錄步驟用融点为65-85℃的水不溶惰性固体與反应液分開。