[发明专利]一种转录因子活性检测方法及试剂盒

摘要

一种转录因子活性检测方法及试剂盒，该方法是基于ELISA检测方法的改进，其特别之处是采用一种新的双链寡核苷酸探针构建，以克服ELISA检测方法双链寡核苷酸探针的设计构建所带来的不足。实验证明，本发明检测方法达到了很高的灵敏度和检测特异性，说明这种设计的探针是完全可以用于转录因子活性检测的，含一个拷贝与两个拷贝结合序列的探针的检测效果是相同的。本发明还涉及这种转录因子活性检测方法所用的试剂盒。

主权项

1、一种转录因子活性检测方法，它至少包括以下步骤：①细胞培养、细胞总蛋白的提取，②将双链寡核苷酸探针1或2固定在亲和素包被的酶标板上：将2pmol双链寡核苷酸探针1或2溶解在50ulPBS中，加入到亲和素包被的酶标板小孔中，37℃，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤2次，PBS洗1次；③将提取的总蛋白与双链寡核苷酸探针1或2结合：每孔加入20μl总蛋白及30μl binding buffer，室温振荡80rpm，孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤3次；④将一抗转录因子抗体，结合到转录因子-探针复合物上：每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶200稀释的转录因子抗体100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％ Tween-20洗涤3次；⑤将HRP标记的二抗Ig-G结合到转录因子抗体-转录因子-探针复合物上：每孔加入用PBS+0.1％BSA作1∶10000稀释的HRP标记的二抗Ig-G100μl，室温孵育1小时后，PBS+0.1％Tween-20洗涤4次；⑥显色反应：每孔加入四甲基联苯胺，使用液100μl，10分钟后加入终止液2MH2SO450μl，450nm处读数，655nm作参照；⑦空白对照设置：在第③步中，每孔不加入20μl总蛋白，而是加入20μl裂解缓冲液Lysis Buffer，其余过程完全相同。所有最后的结果表达为酶标仪上读数OD值减去空白对照所得的差值；其特征在于所述双链寡核苷酸探针1或2是按以下方法制备的：第一链：含转录因子特定结合序列2个拷贝，5’-转录因子特定结合序列-转录因子特定结合序列-C-(C)N-C-3’，此链3’端作生物素标记；第二链：含转录因子特定结合序列结合序列1个拷贝，58个碱基，5’-转录因子特定结合序列-C-(C)N-C-3’，此链3’端作生物素标记；第三链：转录因子特定结合序列结合序列反义链，22个碱基，5’-转录因子特定结合序列-3’；以上三条链中，第二链与第三链、第一链与第三链分别按1∶1、1∶2摩尔数比进行混合，置94℃水浴锅变性10分钟后取出，使其褪火过夜，聚合成双链即为探针1、探针2。