[发明专利]以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法

摘要

本发明公开了一种以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法。它的纯化步骤由粗酶液的制备、凝胶层析和离子交换层析组成，将保存的枯草芽孢杆菌经斜面活化、种子培养基培养、发酵培养基发酵，纳豆激酶由枯草杆菌分泌至发酵液；将发酵培养基离心收集上清发酵液，然后进行(NH₄)₂SO₄分级沉淀，再用磷酸缓冲液复溶；将复溶液加入到凝胶层析柱中进行凝胶过滤，收集含纳豆激酶的洗脱峰，将凝胶过滤得到的具有纳豆激酶活力的部分混合均匀后加到离子交换层析柱中进行吸附，收集含纳豆激酶的洗脱峰；最后通过冷冻干燥得到纯品的纳豆激酶，本发明具有作用条件温和、成本低、工艺简单、操作方便、产品纯度高、生产周期短等优点。

主权项

1.一种以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于：其方法步骤如下：1)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度离心8～15min，收集上清液，在上清液中加入10～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，2000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重新溶解于5～100mM、pH5～8的磷酸缓冲液中，2000～10000rpm离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用；2)凝胶层析分离用层析系统将上清液以10～100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和260nm进行检测，收集保留体积为9～15ml处的洗脱液，收集液体积为3～6ml；3)离子交换层析分离用层析系统将洗脱液液以15～75cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～2M、pH6～8的磷酸缓冲液和0.1～1M的NaCl以相同的线速度进行线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、260nm进行检测。收集含纳豆激酶的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用；4)冷冻干燥收集活性蛋白将收集的活性洗脱液在去离子水中进行透析脱盐16-32h后，置于-20℃冰箱下冷冻12～24h，再将其进行冷冻干燥，干燥时间为24～48h。