[发明专利]一种由廉价乳酸钠经多步偶联生物转化制备高价值唾液酸的方法

摘要

本发明公开了一种由廉价乳酸钠经多步偶联生物转化制备高价值唾液酸的方法。该方法包括含有乳酸氧化酶菌株的培养、含有唾液酸醛缩酶的大肠杆菌工程菌株即E.coliHB101(pBV220－ALD)的构建和培养、N－乙酰氨基甘露糖胺的制备、利用分别含乳酸氧化酶和唾液酸醛缩酶的完整细胞以廉价的乳酸钠为前体转化合成唾液酸以及通过离子交换分离纯化唾液酸等步骤。本发明的方法具有成本低廉，操作简单，转化条件要求宽泛，能有效解除丙酮酸钠对乳酸氧化酶的产物抑制等特点。为生物转化法大规模生产唾液酸提供了可能。

主权项

1.一种由廉价乳酸钠经多步偶联生物转化制备高价值唾液酸的方法，其步骤顺序如下：(1)乳酸氧化酶菌种：选择不动杆菌(Acinetobacter sp.)ATCC11171、假单胞菌(Pseudomonas sp.)ATCC11452之一；(2)斜面培养：将上述菌株接种于含有质量体积比为1.5～2.0％琼脂并加有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠的固体斜面基本培养基上，25℃～45℃培养15～30小时；(3)一级种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于20～100mL含有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠液体基本培养基BLM中，25℃～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得一级种子；(4)扩大培养：以5％体积比的接种量，接一级种子于300～1000mL含有质量体积比为0.2-3％的DL型或L型乳酸钠BLM中，25℃～45℃条件下，在摇床上振荡培养10～30小时，制得二级种子；(5)发酵罐培养：以5％体积比的接种量，接二级种子于1.8～8L含有质量体积比为0.2～3％的DL型或L型乳酸钠的BLM中，25℃～45℃条件下，培养15～40小时，期间以2，4-二硝基苯肼即DNP与丙酮酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞酶活，至酶活达到0.9～2.0U/ml时，终止发酵培养；上述的液体基本培养基BLM，具体配方按质量体积比是：KH2PO4 0.1％，K2HPO4·3H2O 0.08％，NH4Cl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2·2H2O 0.005％，酵母粉0.1％，金属离子混合液0.12％；调节pH7.0，115℃条件下灭菌20分钟；金属离子混合液的配方如下(g/L)：Na2EDTA，50；ZnSO4·7H2O，20；MnCl2·4H2O，5；(NH4)6Mo7O24·4H2O，1，；FeSO4·7H2O，5；CuSO4·5H2O，1.5；CoCl2·H2O，1.6；CaCl2·2H2O，5.5；(6)收集菌体：取步骤(5)的发酵液5,000转/分条件下离心5～8分钟，并用生理盐水洗涤2～3次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体，将所得的菌体即生物催化剂A，在4℃储存，备用；(7) 唾液酸醛缩酶菌株的构建：以常规的方法构建大肠杆菌工程菌株即E.coliHB101(pBV220-ALD)；其中宿主为E.coli HB101；唾液酸醛缩酶(EC4.1.3.3)基因由E.coli K12菌株的基因组DNA中PCR扩增得到；质粒为pBV220；5’端的引物为AGGAATTCATGGCAACGAATTTAC，加上一个EcoR I的位点；3’端的引物为TCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT，加上一个Pst I的位点；(8)平板培养：将步骤(7)所得的菌株划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的含100μg/mL的氨苄青霉素LB平板上；(9)一级种子：在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(8)平板上的一个单菌落，然后接种到5 mL的含100μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，25℃～40℃摇床振荡培养10～12小时；(10)二级种子：在无菌条件下，取步骤(9)所培养的培养液以体积比为2％的接种量，接种到30mL～500mL含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基中，25℃～40℃摇床振荡培养5～10小时；(11)发酵罐培养：在无菌条件下，取步骤(10)所得的培养液以体积比为8％的接种量接种2L～10L的改良的M9液体培养基，25℃～40℃培养5～12小时，改变温度为42℃～50℃培养3～7小时；上述改良的M9液体培养基，具体配方按质量体积比是：蛋白胨0.5％～2％；酵母粉0.25％～0.6％；Na2HPO4·7H2O 0.5％～2％；KH2PO40.1％～0.5％；NaCl 0.02％～0.1％；NH4Cl 0.05％～0.2％；CaCl2 0.0011％；葡萄糖0.2％～2％；115℃灭菌15分钟；(12)收集菌体：将步骤(11)培养得到的培养物5,000转/分钟离心5～30分钟；并用质量体积比为0.85％的氯化钠水溶液洗涤菌体1～3次，以相同的离心条件，收集沉淀菌体；将菌体置于0℃～-30℃的冰箱中冷冻保存，即得到生物催化剂B，待用；(13)N-乙酰氨基甘露糖即ManNAc的异构化：取100～400g的N-乙酰氨基葡萄糖即GlcNAc和2.2～8.8g的氢氧化钠溶解在1～4L水中，然后在室温的条件下，异构化反应36～96小时；(14)浓缩：将步骤(13)所得的异构化溶液经过732H型的离子交换树脂或用冰乙酸调节pH值为5～7；然后在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩或加入6-10倍体积的异丙醇，除去沉淀后再在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩，得到黄色的GlcNAc和ManNAc的固体混合物；(15)ManNAc富集：将步骤(14)得到的黄色固体，用0.5～3倍体积的甲醇浸泡12～36小时或用甲醇回流萃取0.5～2小时，抽滤将固液分离，得到ManNAc的富集液；(16)浓缩ManNAc：将步骤(15)中得到的富集液，在真空度0.08～0.1MPa，30℃～70℃的条件下浓缩，得到油状的物质，即为ManNAc富集物，在-20℃冰箱中保存待用；(17)转化实验：将步骤(6)所得的生物催化剂A和步骤(12)所得的生物催化剂B与底物乳酸钠和步骤(16)所得的ManNAc富集物混合；在5℃～40℃，pH6.0～9.0条件下，180转/分钟振荡5～50小时，使底物乳酸钠、ManNAc、生物催化剂A、生物催化剂B与空气充分混合，完成转化；上述反应混合物中底物乳酸钠的浓度为200～700mM；ManNAc富集物的浓度为40～100g/L；生物催化剂A的浓度：湿细胞5～80g/L；生物催化剂B的浓度：湿细胞1～10g/L；(18)转化液的预处理：将步骤(17)所得的转化液，用732H型树脂或者冰乙酸调节pH至4～5，以5,000～12,000转/分离心5～10分钟，去除步骤(17)中所加入的生物催化剂A和生物催化剂B，得到上清液，即为含有唾液酸的转化液预处理液；(19)树脂处理：将选用的HZ201×8树脂、330树脂或者717树脂之一，用3～6倍柱体积的1 N～2 N的氢氧化钠水溶液以每小时0.5～2倍柱体积流速洗柱子，然后用去离子水将离子交换柱洗至中性；再将树脂用3～6倍体积的1N～3N的甲酸水溶液以0.5～2倍柱体积流速将树脂转型为甲酸型，用去离子水将树脂洗至pH6～7，然后待用；(20)上柱：将步骤(18)所得的转化液预处理液以0.5～2倍柱体积流速上步骤(19)处理所得的离子交换柱，上柱过程中检测流出液中有没有唾液酸漏出，若有漏出即停止上样；(21)洗脱：将步骤(20)处理过的离子交换柱的，先用2～4倍柱体积的去离子水以每小时0.5～2倍柱体积流速冲洗柱子；以相同的流速用0.5N～1N的甲酸水溶液先洗脱1～4倍的柱体积，再用的甲酸水溶液洗脱，收集在以1N～3N的甲酸水溶液洗脱过程中流出的含有组分唾液酸的流出液；(22)浓缩：将步骤(21)收集的流出液，在真空度0.08～0.1MPa，25℃～50℃的条件下浓缩2～6倍；(23)冰乙酸沉淀：将步骤(22)所得的浓缩液中加入体积比为4～10倍的冰乙酸，4℃下静置，结晶2～6天；(24)唾液酸晶体收集：将步骤(23)得到的晶浆用抽滤的方法去除冰乙酸，用体积比为3～6倍的冰乙酸洗涤晶体；最后将所得的晶体，在30℃～70℃，真空度为0.08～0.1MPa的条件下，干燥2～8小时；(25)样品检测：将步骤(24)所得的唾液酸粉末，用13CNMR和HPLC检测产品的纯度。