[发明专利]多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备

摘要

本发明公开了一种多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备方法。通过分子生物学操作，将hPAB构建成多拷贝体，并由表达载体介导在大肠杆菌中高效表达，多拷贝体表达量占细菌总蛋白的15～25％。以三拷贝工程菌为例，表达量为20％，纯化的一个三拷贝体分子经裂解可获得3个活性单体，制备效率增加了200％。本发明公开的制备方法具有分离纯化方法简单，成本低，易于放大，产物纯度高、杀菌力强等优点，可广泛地应用于医药、食品保鲜及护肤品等领域。

主权项

1.多拷贝串联肽抗生素hPAB的制备，其特征是：首先根据肽抗生素hPAB氨基酸序列对应的核苷酸序列设计一对PCR引物：上游引物P1：下游引物P2：然后通过PCR技术在hPAB基因的5’端依次加上核酸内切酶BamHI、AvaIII，天冬酰胺对应的核苷酸序列，在hPAB基因的3’端依次加上甘氨酸对应的核苷酸序列，核酸内切酶PstI，终止密码子TAA和核酸内切酶HindIII。PCR产物回收后用BamHI和HindIII酶切，用T4 DNA连接酶将之连接到pQE-32表达质粒的BamHI/HindIII位点上，采用酶切、核苷酸测序筛选阳性重组子。提取阳性重组子质粒，分为两份，一份用XhoI+AvaIII双酶切后回收大片段(含单拷贝hPAB)，另一份用Xho I+Pst I双酶切后回收小片段(含单拷贝hPAB)，将大、小片段用T₄连接酶连接后即可得含双拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-2；若再将pQE-hPAB-2质粒分两份，一份用XhoI+AvaIII双酶切后回收大片段(含双拷贝hPAB)，另一份用Xho I+Pst I双酶切后回收小片段(含双拷贝hPAB)，将大、小片段用T₄连接酶连接后即可得含四拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-4；若将上述双酶切后含双拷贝hPAB的大片段与含单拷贝hPAB的小片段连接即可获得含三拷贝hPAB的重组质粒pQE-hPAB-3；如此重复，分别构建含1～8拷贝hPAB重组体的工程菌，进行表达。上述克隆的技术路线如下：BamHI  AvaIII Asn hPAB    Gly PstI   Stop codon HindIIIGGATCC GATGCA AAC ＝      GGC  CTGCAT   TAA     AAGCTT