[发明专利]以疏水层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450bm－3的方法

摘要

本发明公开了一种以疏水作用层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450_bm－3的方法。它的纯化步骤由粗酶液的制备、疏水层析和凝胶层析组成，其中在工程菌发酵中，将保存的表达P450_bm－3的大肠杆菌经种子培养基活化、发酵培养基发酵，细胞色素P450_bm－3在大肠杆菌细胞内表达；在粗酶液的制备时，将发酵培养基离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心后取上清液，然后进行(NH₄)₂SO₄分级沉淀，再用含(NH₄)₂SO₄的缓冲液复溶；在疏水层析分离时，将复溶液加到疏水层析柱中进行吸附，收集含P450_bm－3的洗脱峰；最后通过凝胶层析分离，将收集的洗脱液加入凝胶层析柱中，收集含P450_bm－3的活性洗脱峰，纯度达到90％以上，活性回收率13.5％，纯化倍数13.7，本发明具有作用条件温和、成本低、工艺简单、操作方便、生产周期短等优点。

主权项

1.一种以疏水层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450bm-3的方法，其方法步骤如下：1)硫酸铵分级沉淀用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000rpm的速度离心8～15min，收集菌体，用冰水洗去培养基的杂质，重悬于0.8～1.5M(NH4)2SO4、0.1M PMSF、0.1M EDTA、pH6～8的磷酸缓冲液中，用超声波破碎仪在100～300W下破碎，然后以2000～10000rpm的速度离心8～30min，收集上清液，在上清液中加入20～40％饱和度的(NH4)2SO4沉淀，2000～10000rpm离心收集上清液，继续在上清液中加入(NH4)2SO4至60～85％的饱和度，2000～10000rpm离心收集沉淀，将沉淀重悬于0.8～1.5M(NH4)2SO4、0.1M PMSF、0.1M EDTA、pH6～8的磷酸缓冲液中，2000～10000rpm离心10～30min收集上清液，于0～20℃保存备用。2)疏水层析分离用层析系统将保存的上清液以15～60cm/h的线速度加入层析柱中，用含有0.2～2M(NH4)2SO4、10～200mM、0.1M PMSF、pH6～8的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至波长为280nm时的紫外吸收峰为零，再用不含(NH4)2SO4相同的磷酸缓冲液线性梯度洗脱，用紫外检测仪在波长为280nm、417nm进行检测。收集含P450bm-3的活性峰洗脱液，洗脱液于0～10℃条件下保存备用。3)凝胶层析分离用层析系统将疏水层析分离得到的活性洗脱峰收集液以10～100cm/h的线速度加入凝胶层析柱中，用10～200mM的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪在波长为280nm和417nm进行检测，收集保留体积为9～12ml处的洗脱液，收集液体积为3～5ml。