[发明专利]一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法无效
| 申请号： | 03115320.8 | 申请日： | 2003-02-08 |
| 公开（公告）号： | CN1446911A | 公开（公告）日： | 2003-10-08 |
| 发明（设计）人： | 吴奇能 | 申请（专利权）人： | 复旦大学 |
| 主分类号： | C12N9/50 | 分类号： | C12N9/50;C12N15/70;C12N15/57;C12P21/00;C07K1/14 |
| 代理公司： | 上海正旦专利代理有限公司 | 代理人： | 陆飞,滕怀流 |
| 地址： | 20043*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | 本发明是一种人工基团生产嗜热菌蛋白酶的方法。它通过构建表达载体—转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶。本发明蛋白酶收率高，得到的蛋白酶活性也高，达到300－400万U/g，且生产成本低。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 人工 基因 生产 嗜热菌 蛋白酶 方法 | ||
【主权项】：
1、一种嗜热菌蛋白酶的生产方法，其特征在于是通过构建表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达嗜热菌蛋白酶，具体步骤如下：(1)蛋白酶全长基因的克隆根据嗜热菌蛋白酶的氨基酸序列，以及大肠杆菌BL21(DE3)的密码子偏爱性，人工合成小的DNA片断，用PCR法，在90-98℃使双股DNA变成单股DNA，再在45-55℃，引物与互补正链同种顺序DNA组合，另一引物与负链同种顺序的DNA组合；然后，控制温度68-72℃，形成多聚酶作用，组合的引物向一方向伸长，形成2个新的双股DNA；DNA变性，克隆合成嗜热菌蛋白酶全长基因ptmthm；(2)表达载体的构建以嗜热菌蛋白酶全长基因为模板，以pnmthm1和ptmthm3为引物对，68-72℃，PCR扩增出编码嗜热菌蛋白酶成熟肽的cDNA片断；经DNA片断回收、连接、转化与pET-30a表达质粒重组得到嗜热菌蛋白酶全长基因重组表达质粒pET30a-ptthm；其中pnmthm1为：AATAAAGTAGAACATACCGGTACAAGT，ptmthm3为：AGCTCTCGAGCTACTTGACTTGACTCCAACT；(3)表达与包含体的分离纯化所构建的表达载体——转化大肠杆菌BL21(DE3)，经接种培养至OD600为0.2-1.0时以异丙基硫代半乳糖苷诱导表达3-6小时，收集一定量的表达菌体，再进行分离纯化，使蛋白变性。
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