[发明专利]生产截短型重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽的方法

摘要

本发明涉及一种构建基因工程菌生产截短型重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽(rhBMP－2－108)的方法,该方法通过构建含截短型人BMP－2基因的基因工程菌而得到表达量高的重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽,更易于纯化和复性,因而有更高的生物活性。本发明的基因工程菌所产生的人截短型BMP－2的量达到细菌总可溶蛋白量的30～50%,本发明建立的重组蛋白分离纯化技术简便实用,有利于大量生产医疗用的BMP－2,为其用于临床,造福病人奠定基础。

主权项

1.生产截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1)人工合成编码BMP-2羧基端107个氨基酸残基的核苷酸序列，并在第一个氨基酸残基密码子之前加上了起始密码子ATG和限制性内切酶的识别位点，将第二个氨基酸精氨酸残基突变为赖氨酸残基和在最后一个氨基酸残基的密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点，构成截短型人BMP-2基因SEQID：NO：1长度：324bp类型：脱氧核糖核酸链数：双链几何结构：线性来源：人工合成特征：编码人BMP-2成熟肽羧基端的107个氨基酸残基的序列人BMP-2-108的基因编码序列：5’ATGAAAAAACTGAAATCCTCCTGCAAAAGACATCCGCTGTATGTGGATTTTAGCGATGTGGGCTGGAACGATTGGATTGTGGCGCCGCCGGGCTATCATGCGTTTTATTGCCATGGCGAATGCCCGTTTCCGCTGGCGGATCATCTGAACTCCACCAACCATGCGATTGTGCAGACCCTGGTGAACTCTGTGAACAGCAAAATTCCGAAAGCGTGCTGTGTGCCGACCGAACTGAGCGCGATTTCGATGCTGTATCTGGATGAAAACGAAAAAGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGATATGGTGGTGGAAGGTTGTGGCTGTCGCTAA3’人BMP-2-108的氨基酸残基序列：MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)构建含BMP-2-108基因的表达载体，将合成的BMP-2-108基因和含有与该基因相同限制性内切酶识别位点的载体分别用相关限制性内切酶切开，酶切温度为25～38℃，酶切时间为1～5小时，然后将酶切产物进行1～2％的琼脂糖凝胶电泳，用常规方法从凝胶中回收并纯化载体和基因两个DNA片段，再将两个片段同时置于T4DNA连接酶反应缓冲液中，加入T4DNA连接酶，在4～22℃下进行为时1小时-1周的连接反应，其中所使用的基因表达载体或为用化学试剂诱导插入基因表达的载体或为通过温度变化诱导插入基因表达的载体；3)采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞：用无菌铂丝直接蘸取冻存的大肠杆菌，在LB平板表面划线，于25～38℃下培养10～20小时，将1个分隔良好的单菌落接种到50-100毫升LB培养液中，在25～38℃下，以150～300次/分钟的振荡速度培养至OD600＝0.3-1.0，将培养物装于离心管内，置冰上5～20分钟，随后，将培养物于2～6℃离心5～20分钟，速度为1500～2000g，将离心所得的沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液悬浮之后，第二次在2～6℃下离心5～7分钟，速度为1000～1500g，将离心所得沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液悬浮，冰上放置28～32分钟，然后第三次在2～6℃下离心5～7分钟，速度为1000～1500g，将离心所得沉淀用2～5毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液悬浮，最后按每管100～200微升的量将悬浮液分装于无菌离心管中，将管口密封后，立即冻于-70℃；4)将上述第2)步所得的连接反应物与第3)步所得的感受态细菌混匀，在冰上放置10～50分钟，接着在42℃的水浴中放置30～150秒，再冰浴1～10分钟，然后加入0.5～5毫升的LB培养基，在28～38℃的水浴或培养箱中温浴20～120分钟，随后，将150～250微升被转化的感受态细胞涂布到含有相应抗生素的LB平板上，将平板置于室温下直至液体被吸收后，倒置平板，于25～38℃培养箱中培养10～30小时后，即可出现重组菌的菌落，至此完成质粒的转化过程；5)从转化后的大肠杆菌的固体平板上挑取单菌落，接种于装有1～10毫升LB培养液的试管中，在25～38℃的温度下中速振荡培养6～15小时，再对收获的菌体采用常规的碱裂解法抽提质粒DNA；6)将上述抽提的DNA用限制性内切酶酶切鉴定，酶切温度为30～37℃，酶切时间为1～3小时，正确重组子中应当含有300～400bp(BMP-2-108)及5～6kb(载体DNA)的酶切片段，凡能切出上述大小酶切片段的克隆即为转化了新的基因(rhBMP-2-108)的克隆，构建基因工程菌获得成功；7)在含葡萄糖的LB培养基中培养基因工程菌：按1％的接种量将基因工程菌接入5～10毫升的LB培养基中，以振荡速度100～200次/分培养2～3小时，对以化学试剂诱导插入基因表达的载体，培养温度是30～32℃，对通过温度变化诱导插入基因表达的载体，培养温度是28～30℃；8)rhBMP-2-108基因的诱导表达，在进行7)步骤后，按1％的比例，将培养物接种到含有200～500毫升LB培养基的三角烧瓶中，以200～300次/分的振荡速度，在步骤7)指定的培养温度下将基因工程菌培养至OD600＝1.2～1.4，培养时间为10～12小时，然后，接入大罐中的LB培养基中继续培养，接种量为5∶1(培养液∶种子液)，pH7.0，对于以化学试剂诱导插入基因表达的基因工程菌，培养温度为30～32℃，搅拌速度100～600转/分，培养4个小时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体，对于通过温度变化诱导插入基因表达的基因工程菌则将培养温度迅速升到42～45℃，并在剧烈震荡下继续培养3～4小时，然后在8000～10000转/分离心收集菌体；9)用物理方法或化学试剂裂解细胞，抽提重组蛋白质，经复性，分离，纯化后，获得本发明的产品截短型重组人骨形态发生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)。