[发明专利]识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法

摘要

一种识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法,经分离纯化病毒,将单链抗体基因克隆到噬菌体表达载体,融合蛋白的形式单链抗体片段由重链和轻链可变区域组成,用一可弯曲小肽连接成氨基酸单链,其DNA通过PCR技术对mRNA进行反转录和扩增,克隆到噬菌体表达载体,噬菌体抗体从重组噬菌体抗体cDNA文库淘选,选择专一识别对虾白斑杆状病毒的抗体,适用于对虾病毒病的早期检测,通过适合载体,可用于对虾白斑杆状病毒病的防治。

主权项

1、一种识别对虾白斑杆状病毒单链抗体的制备方法，其特征是，该方法包括如下步骤：(1)采用蔗糖密度梯度超速离心法，用电镜检测，从感病斑节对虾的血淋巴液中分离纯化白斑杆状病毒；(2)用蛋白量为20～150μg纯化的完整对虾白斑杆状病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐剂或福氏佐剂或氢氧化铝等常用佐剂，经17～26天进行二次或三次免疫，再经3～5天用酶联免疫印迹法和酶联免疫吸附法测定抗体效价，取抗体效价最高的小鼠脾脏，从中提取mRNA；(3)将此mRNA反转录为cDNA，再用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增；(4)用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接起来组成单链抗体DNA，再用对应诊断单链抗体DNA的引物用PCR技术将整个片段扩增；(5)将单链抗体DNA片段两端的限制性内切酶位点(SfiⅠ和NotⅠ)酶切，再与具同样酶切位点的噬菌体表达载体连接，电转移至大肠杆菌中，可获得较高效价的噬菌体抗体cDNA文库；(6)用吸附在朔料管壁上的对虾白斑杆状病毒对上述噬菌体抗体文库进行1～4次淘选，用酶联免疫吸附法筛选可得到抗原结合专一性的阳性克隆，该阳性克隆分泌的单链抗体可专一性识别对虾白斑杆状病毒。