本发明公开了反转录酶HIV p66突变体及其应用。本发明将氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的野生型反转录酶HIV p66同时进行D76A、R78K、W229Y、M230L、V75F和F77A突变得到氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的突变体。本发明还公开了所述反转录酶HIV p66突变体的编码基因、含有所述编码基因的重组表达以及宿主细胞。本发明进一步公开了制备所述突变体的方法。本发明所提供的突变体能够在面对特殊的RNA修饰和复杂二级结构的RNA的修饰也不会提前终止反应，与野生型反转录酶相比，本发明突变体具有更高的酶活，对含有m1A修饰的5‘UTR序列或tRNA也能够高效进行反转录。
