本发明公开了一种含有双sgRNA的特异性基因敲除的CRISPR/Cas9编辑质粒,包括双sgRNA和上下游同源臂,所述双sgRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;所述的上下游同源臂是以A.keratiniphila HCCB10007基因组为模板,分别用SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示的引物进行PCR扩增获得。本发明还公开了所述的CRISPR/Cas9编辑质粒在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行大片段基因敲除的应用。本发明实现了在水解角蛋白拟无枝酸菌中进行80kb以上大片段基因的精准敲除。