本发明公开了一种分泌乳酪蛋白的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，其中所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为出发菌株，敲除了内切‑β‑1,3‑1,4‑葡萄糖苷酶基因的编码区，并整合表达α‑S1‑酪蛋白基因、β‑酪蛋白基因和氯霉素抗性基因，其中所述α‑S1‑酪蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、所述β‑酪蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明以枯草芽孢杆菌的bglS基因为基础，利用同源重组的方法，将α‑S1‑酪蛋白基因和β‑酪蛋白基因以及氯霉素抗性筛选标记基因串联在一起，替换bglS基因编码区，利用麦芽汁诱导即可获得了高效分泌酪蛋白的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌，可作为饲料添加剂，在断奶仔畜、畜禽和水产动物生产中具有极高的应用前景。
