本发明涉及基因工程技术领域,尤其是涉及一种狂犬病毒的重组基因、重组假病毒及其构建方法和应用。所述重组基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将重组基因RABV‑G‑N置换慢病毒包膜质粒中的VSV‑G,构建重组包膜质粒pCMV‑RABV‑G‑N,然后将重组包膜质粒与含绿色荧光蛋白报告基因的pLV‑eGFP和psPAX2共转染人胚胎肾细胞HEK‑293T即得到重组假病毒。本发明的重组基因具有与天然狂犬病毒的生物学特性,可以提高假病毒免疫原性,并且制备的重组假病毒包装滴度高,可以替代天然狂犬病毒进行血清中和抗体滴度的评价。