本发明公开了一种米黑根毛霉脂肪酶突变体及其应用,所述突变体命名为P46N‑pRML,是将米黑根毛霉脂肪酶前导肽中第46位氨基酸从脯氨酸突变成天冬酰胺,突变体P46N‑pRML的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明的米黑根毛霉脂肪酶突变体,具有较高的酶活性。本发明通过构建恰当的表达载体,使米黑根毛霉脂肪酶突变体基因在巴斯德毕赤酵母X‑33中分泌表达,表达的单双酰脂肪酶大部分分泌到细胞外,降低了分离纯化成本,而且表达效率较高,最适反应温度和pH耐受性分别提升到45~50℃和pH 5~11,酶的比活也提高到1.9倍。本发明为米黑根毛霉脂肪酶的工业化应用奠定了基础。