本发明提供一种半胱氨酸强化的重组蜘蛛丝及其制备方法和应用。重组蜘蛛丝蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO:6所示的序列。编码该蛋白氨基酸序列的多核苷酸具有如下结构:半胱氨酸改良的育儿网蛛大壶状腺丝MaSp2基因的5’端连接有N‑结构域、3’端连接有C‑结构域;将其基因插入到pET‑28a质粒载体中获得重组质粒,导入到大肠杆菌中进行表达得到重组蜘蛛丝蛋白。利用该重组蜘蛛丝蛋白通过湿法纺丝制备获得的重组蜘蛛丝具有致密的β‑sheet晶体结构、优异的机械性能和湿强度,为重组蜘蛛丝的产业化应用开拓前景。