本发明涉及一种以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW2及其制备方法和应用,所述穿梭质粒的碱基序列如SEQ ID NO.1所示,所述衍生质粒是以绿色荧光蛋白作为报告基因的启动子筛选载体。所述制备方法包括以下步骤:敲除噬菌体中质粒复制表达非必需的基因,融合氯霉素基因、克隆复制起始位点、克隆结合转移元件、多克隆位点插入到所述噬菌体基因区域,获得pSW2表达载体;同时将绿色荧光蛋白插入多克隆位点,筛选不同强度的启动子序列,构建生成启动子筛选载体。本发明提供的穿梭质粒能够在大肠杆菌内和不同的希瓦氏菌中复制表达,同时可作为基因回补载体应用于希瓦氏菌基因的功能鉴定,也可以在低温下高效表达外源基因。