本发明公开了猪λ3干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的猪λ3干扰素及其编码基因。本发明将猪λ3干扰素编码基因按照家蚕密码子偏好性进行密码子优化得到抗病毒活性提升的SEQ ID NO.3所示的优化基因。本发明进一步将SEQ ID NO.3所示的优化基因分别进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变获得多个抗病毒活性呈显著提升的猪λ3干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述猪λ3干扰素突变体,所表达产物的抗病毒活性提高显著。本发明提供的猪λ3干扰素突变体能够用于制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂。