本发明公开了一种腺病毒多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液、引物探针组合、阳性质控品、阴性质控品，还包括核酸提取用液及核酸提取用内参照品；所述内参照品为灭活的T4噬菌体，所述引物探针组合包括腺病毒核酸用引物探针（通用：SEQ ID NO4-6；分型SEQ ID NO7-9）及内参照品用引物探针(SEQ ID NO1-3)，其中SEQ ID NO3、6、9的5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团；本发明还公开了上述试剂盒的使用方法，在荧光定量PCR检测反应前还采用核酸提取用液进行病毒核酸提取，并在病毒核酸提取过程中加入所述内参照品；本发明的试剂盒及其使用方法具有使用便捷、检测结果准确的特点，其不仅可以对所有腺病毒进行检测，还可以对B和E亚群进行分型。
