本发明属于生物技术领域,公开了一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途。一种适于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板,所述线性DNA模板依次包括含有启动子的片段、限制性内切酶BsaI的编码基因和含有终止子的片段,所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述线性DNA模板不含有限制性内切酶BsaI的酶切位点。本发明的线性DNA模板,能有效防止线性DNA模板被核酸酶降解,其能够适用于任意的体外无细胞蛋白体系且能顺利表达,采用本发明的线性DNA模板进行体外无细胞蛋白合成,获得的限制性内切酶BsaI的纯度高、比活高。