[发明专利]运用CRISPR/Cas9系统创制粉色果实番茄的基因编辑方法

说明书

技术领域

本发明涉及番茄转基因材料的构建，特别涉及运用CRISPR/Cas9基因编辑系统将红果番茄材料转变为粉果番茄材料的基因编辑方法。

背景技术

番茄是世界上最重要的蔬菜作物之一，也是果实类研究模式植物。目前在番茄生产上，欧美地区消费习惯以大红色果实番茄为主，而部分亚洲国家，尤其是中国和日本，则有一定的粉色果实番茄消费习惯。由于红果番茄育种工作开展早、积累材料丰富，红果番茄材料的丰产性、抗病性和商品性等相关特征总体上优于粉果番茄。因此，在育种工作中可利用的红果优异种质资源也远多于粉果材料。番茄果实颜色取决于果皮和果肉颜色，当果肉颜色为粉红色时，黄色果皮的番茄果实呈现红色，而透明果皮的番茄呈现粉红色。SlMYB12是番茄MYB转录因子家族成员之一，相关文献证明SlMYB12基因编码蛋白通过转录调控番茄果皮中类黄酮含量决定果皮颜色，当SlMYB12突变时，类黄酮合成路径被阻断，番茄果实果皮颜色呈透明。

在过去数年中，有相关研究通过QTL，病毒诱导基因沉默等生物学技术手段进行SlMYB12与透明果皮之间的相关性研究。但是以上技术手段不能完全抑制SlMYB12基因在番茄中的转录和翻译，且获得的材料不能稳定遗传。

CRISPR/Cas9基因编辑技术是近几年新发展起来的一种基因组定向编辑技术。至今为止，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在多种植物中实现了定点突变诱导(插入、缺失或修饰等)。由于成本低廉、操作简易和突变诱导率高等特点，CRISPR/Cas9系统作为一项高效植物遗传改良和育种研究的分子操作技术手段，应用前景十分广阔。但是，目前尚无运用该技术敲除水稻SlMYB12基因，实现番茄果实颜色从红色转为粉色的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有传统番茄育种技术周期长、效率低的不足和现有转基因技术无法定向敲除基因的问题，提供一种运用CRISPR/Cas9系统敲除红果番茄材料SlMYB12基因的基因编辑方法，以获得完全丧失SlMYB12功能，稳定遗传且无外源基因插入的理想粉果番茄突变体。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种运用CRISPR/Cas9系统敲除番茄SlMYB12基因编辑方法，包括以下步骤：

(1)gRNA靶位点的选择，SlMYB12位于番茄基因组的1号染色体上，利用CRISPR-Plant在线设计工具，根据CRISPR/Cas9技术设计靶位点的原则，把靶位点设计在SlMYB12基因的5’端第一个外显子上；

(2)gRNA的片段克隆，以番茄(Solanum lycopersicum)基因组DNA序列为参考，设计两段oligo序列，其中F和R分别代表正、反向引物：

Target-F：5’-TTGTGGGCATCAAGAGAGGCAGA-3’

Target-R：5’-AACTCTGCCTCTCTTGATGCCCA-3’

反应体系为：Target-F 5μL；Target-R 5μL；H₂O 15μL

反应条件为：95℃，3min；95℃到25℃室温条件下缓慢冷却；16℃5min；

(3)靶标序列插入Cas9/sgRNA载体：将上一步获得的退火oligo产物通过同源重组插入Cas9/sgRNA载体。取oligo二聚体1μL，与1μL Cas9/gRNA，1μL Solution 1，1μL Solution 2，6μL H₂O混合均匀，在PCR仪中16℃反应2小时完成重组连接；

(4)载体农杆菌转化：将连接后的载体转化大肠杆菌感受态细胞，卡那霉素(Kanamycin)平板培养过夜，挑取单菌落摇菌培养，抽取质粒样品测序，测序结果正确的质粒转化农杆菌GV3101；

(5)农杆菌介导转化番茄愈伤组织获得转基因植株：以野生型番茄Alisa Craig为材料诱导愈伤组织，进行农杆菌介导的番茄转化实验，经潮霉素抗性筛选，抗性愈伤组织分化再生获得转基因阳性株系；