[发明专利]眼镜蛇毒神经生长因子诱导干细胞成软骨分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及眼镜蛇毒神经生长因子的制备和应用，及其诱导干细胞向软骨分化的方法和用途。

背景技术

关节软骨缺损一直是骨科临床的治疗难题，主要是因为关节软骨没有血供，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复，这样就使得即使是极小的软骨缺损也无法自然修复。当关节软骨小面积的全层损伤后，软骨下骨髓可产生纤维软骨样修复。但这种修复产生的软骨细胞无论是形态还是功能特性与正常软骨相差甚远。事实上，损伤的关节会加速关节的骨化，细胞外基质降解的速率大于新基质的合成，从而导致关节炎。传统的治疗方法包括：关节内清理和灌洗术、关节削软骨磨成形术、软骨下骨钻孔术、关节面钻孔和微骨折法、截骨术等。此类方法可以部分减轻疼痛，有一定短期疗效，但都是以纤维软骨修复软骨组织为主，缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性，通常不能长期维持关节功能，而且还经常加速受损区域组织的进一步退行性变，难以获得满意的临床效果。

组织工程技术通过分离及培养所需的种子细胞、选择适合的支架材料、最后构建组织工程化软骨植入到缺损部位而完成治疗目的，一度成为软骨损伤修复研究的热门。组织工程研究涉及到种子细胞、支架材料和包括多种生长因子在内的生长环境3种基本要素。种子细胞主要包括软骨细胞和干细胞等。由于自体、异体或异种软骨细胞作为组织工程细胞存在来源以及免疫排斥等众多难以克服的限制性因素，因此，近年来，大量研究开始将注意力集中到干细胞研究领域。所谓干细胞，是指一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。来源于骨髓、肌肉、脂肪、骨膜及软骨膜等的干细胞，经一定条件的培养，均能够转化为软骨细胞。其中骨髓来源的间充质干细胞，即骨髓基质干细胞(BMSCs)具有较强的增殖能力，易从骨髓中分离和体外扩增纯化，便于自体移植，目前己经成为关节软骨组织工程研究的最重要的种子细胞来源之一。

现行的已得到普遍认可的BMSCs体外软骨定向诱导方案主要采用外加生长因子，在体外培养中添加转化生长因子（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）等生长因子或活性大分子可诱导干细胞向软骨方向分化。生长因子在软骨组织工程中被广泛采用，可用于诱导间充质干细胞向软骨方向分化，在软骨损伤修复中发挥着重要的作用，促进软骨细胞的增殖、迁移、向软骨细胞分化和基因的表达。但是目前常用的生长因子存在提取工艺复杂、价格昂贵、容易降解等诸多弊端，不利于广泛的临床应用。因此，急需开发和寻找更易提取，成本低廉，同时具有软骨诱导活性的生长因子用于软骨缺损修复。

神经生长因子(NGF)是一类神经营养因子，价格低廉且提取工艺简便，如果能有效诱导干细胞成软骨分化，必将为关节患者带来福音。眼镜蛇毒资源丰富，且随着人工饲养技术的逐渐成熟，蛇毒的获取更为便利，为降低成本提供了空间。蛇毒中蕴藏着大量极具价值的活性物质，其中包括NGF。NGF是能够促进神经细胞生长的生物活性复合蛋白，也是迄今为止研究得最清楚的一个神经营养因子。它具有十分广泛的作用，NGF在轴突的生长、神经元的发育、递质的合成及细胞的凋亡等阶段均起着重要作用，能够促进发育中的感觉神经元及交感神经元的存活及分化，营养成熟的神经元，维持其正常的生物学功能，并参与神经元的损伤修复等，NGF的非神经作用也日益引起人们的关注。已有研究表明，NGF对BMSCs有成骨诱导的作用，对骨缺损修复有积极的促进作用。

目前尚无报道有NGF对BMSCs有软骨诱导作用，且NGF应用软骨修复领域的报道也极少。但种种迹象表明NGF可能会对软骨修复有促进作用。有研究表明，NGF可能会在对抗关节炎中起作用，这在关节炎软骨中观测到有NGF表达。NGF还有可能与促血管因子生成相关，从而与骨关节炎有一定关系。进而有研究发现，NGF及其两个受体在透明软骨、纤维软骨和弹性软骨中均有表达，说明NGF及其受体可能参与软骨代谢过程。其他类似的研究表明，与NGF相近的神经蛋白分子也能促进软骨细胞增殖及软骨特异基质的分泌，可作为间接证据证明NGF会对软骨再生与代谢产生作用。

因此，为解决本领域面临的难题，使组织工程化软骨摆脱生长因子难以提取、价格昂贵、不易推广应用的限制，急需开发和寻找更易提取，成本低廉，同时具有软骨诱导活性的生长因子用于软骨缺损修复。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的价格低廉、功能较强的诱导因子。

为完成本发明目的，本发明采用以下技术方案：

(1)从眼镜蛇毒中分离并纯化神经生长因子NGF；