本发明公开了一种高产阿扎霉素F的基因工程菌及其构建方法与应用,属于基因工程和微生物技术领域。本发明高产阿扎霉素F的基因工程菌为过表达azl4基因(SEQ ID NO.1)和/或azl6基因(SEQ ID NO.2)的链霉菌,其构建方法包括如下步骤:构建强启动子元件驱动目的基因表达的过表达质粒,通过接合转移的方法将所构建质粒转移到产生阿扎霉素F的链霉菌宿主中。本发明通过基因工程手段,对阿扎霉素F生物合成相关的内源基因azl4和azl6进行过表达,使阿扎霉素F的产量得到大幅度提高。本发明为提高阿扎霉素F产量,降低阿扎霉素F生产成本奠定了基础。