本发明公开了一种总状毛霉来源甲壳素脱乙酰酶的生物制备方法,包括下列步骤:(a)制备含基因序列如SEQ ID NO.1所述甲壳素脱乙酰酶的重组表达载体;(b)制备含有步骤(a)所述重组表达载体的转化体;(c)表达和纯化甲壳素脱乙酰酶。本发明设计基因特异性简并引物,采用逆转录-聚合酶链式反应和快速扩增cDNA片段末端技术,结合重组DNA的方法,利用已有的原核表达载体,得到了能够产生甲壳素脱乙酰酶的大肠杆菌菌株。为生物制备甲壳素脱乙酰酶提供了可靠的来源,具有生产周期短、提取成本低、产品酶得率和产量较高等优点。