本发明公开了一种海洋弧菌的多重PCR反应试剂盒及其检测方法,包括PCR反应液,PCR反应液由10×PCR反应缓冲液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌种的DNA引物和灭菌离子水配制而成,致病菌种的DNA引物包括溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌的DNA引物,这样用本发明的试剂盒进行检测就能检测出与上述三种海洋弧菌的DNA引物相对应的溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌;另外由于本发明的检测方法利用上述的试剂盒检测海洋动物的弧菌病的致病菌种,因此能检测出上述的三种海洋弧菌,这样就缩短了检测致病菌种的时间,降低检测成本,从而较快地找出感染弧菌病的海洋动物的致病菌种,达到及时有效的防治,避免了更多的海洋动物感染弧菌病,减少了海水养殖业的经济损失。