本发明属于生物领域,具体涉及一种用于检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的引物探针组合物、试剂盒及方法。本发明公开了一种引物探针组合物,包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑6所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物探针组合物的试剂盒,以及使用该引物探针组合物或试剂盒进行结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌检测的方法。本发明公开的试剂盒基于多重的液滴数字PCR平台,其平台自身存在灵敏度高、适用多重的特性;然后通过自主引物探针对的组合优化,筛选到合理的引物探针对组合;可快速灵敏的检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。