本发明提供了一种重组巴斯德毕赤酵母菌株其构建方法和应用。一种产脂肪酸的重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法,包括:构建具有SEQ ID NO:1所示的靶向核苷酸序列的sgRNA表达载体pPICZ‑Cas9‑gFAA1;将sgRNA表达载体pPICZ‑Cas9‑gFAA1导入巴斯德毕赤酵母菌株,敲除巴斯德毕赤酵母菌株中的KpFAA1基因。本发明还提供了一种脂肪醇合成重组巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法和一种α‑烯烃合成重组巴斯德毕赤酵母菌株。本发明首次实现了毕赤巴斯德酵母脂肪酸衍生物合成,特别是甲醇到脂肪酸的高效生物合成,拓展了甲醇绿色转化路径,并且发掘了巴斯德毕赤酵母在微生物细胞工厂领域的应用潜力。