[发明专利]抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910936105.0 | 申请日： | 2019-09-29 |
| 公开（公告）号： | CN110551212A | 公开（公告）日： | 2019-12-10 |
| 发明（设计）人： | 董少忠;李慧;宋杰;徐婧雯;张雪梅;吴忠香;朱文兵;蒋曦;李卫宇;郑雪麟;刘卓航 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院医学生物学研究所 |
| 主分类号： | C07K16/10 | 分类号： | C07K16/10;C12N5/20;G01N33/569;G01N33/577 |
| 代理公司： | 53100 昆明正原专利商标代理有限公司 | 代理人： | 于洪;陈左 |
| 地址： | 650118 *** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法和应用，通过将目的序列插入原核表达载体中构建重组质粒pGEX‑5X‑1‑VP1，利用大肠杆菌表达系统表达并纯化得GII.4型诺如病毒重组蛋白GST‑VP1，以其为免疫原进行动物免疫并结合杂交瘤技术，通过细胞融合和克隆化筛选阳性杂交瘤细胞株。本发明经过间接ELISA双筛制备的单克隆抗体不仅能够特异性检测GII.4型诺如病毒重组蛋白GST‑VP1，对于GII.4型诺如病毒病毒样颗粒VLP和天然诺如病毒主要衣壳蛋白都表现出显著的识别效果，易于推广应用。 | ||
| 搜索关键词： | 诺如病毒 病毒样颗粒 单克隆抗体 衣壳蛋白 重组蛋白 大肠杆菌表达系统 阳性杂交瘤细胞株 制备方法和应用 构建重组质粒 原核表达载体 克隆化筛选 特异性检测 杂交瘤技术 间接ELISA 动物免疫 细胞融合 免疫原 制备 表现 | ||
【主权项】：
1.抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤（1），免疫原的制备：通过PCR扩增获取诺如病毒衣壳蛋白VP1基因序列，扩增产物与pGEX-5X-1表达载体分别酶切后连接，从而构建重组质粒pGEX-5X-1-VP1，IPTG诱导表达并通过亲和层析纯化得重组蛋白GST-VP1；/n步骤（2），动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以3周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量重组蛋白GST-VP1充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的重组蛋白GST-VP1，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；/n步骤（3），杂交瘤细胞株的制备和筛选：将步骤（2）得到的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后12-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌抗诺如病毒衣壳蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。/n
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