[发明专利]检测环境雌激素类干扰物的酵母重组系统及方法在审
| 申请号： | 201910751535.5 | 申请日： | 2019-08-15 |
| 公开（公告）号： | CN110564753A | 公开（公告）日： | 2019-12-13 |
| 发明（设计）人： | 苗晶晶;刘力铷;潘鲁青;刘佩佩 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/81;C12Q1/40 |
| 代理公司： | 37201 青岛海昊知识产权事务所有限公司 | 代理人： | 邱岳 |
| 地址： | 266100 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 一种检测环境雌激素类干扰物的酵母重组系统及方法，该系统采用以下方法构建：将长牡蛎雌激素受体基因CgER连接到载体pGADT7，构建重组表达质粒；将爪蟾卵黄蛋白原基因ERE连接到载体pGBKT7，构建重组诱饵质粒；将重组表达质粒与诱饵质粒共转化入Y187酵母细胞中，筛选培养阳性克隆菌株。营底栖固着生活的长牡蛎生物毒性蓄积能力强，更能揭示海洋污染物对生物的潜在危害，故长牡蛎被视为一种理想的海洋环境监测生物。以Y187菌株作为酵母宿主，含有报告基因Lac Z，简化了报告质粒的构建，大大降低了重组酵母假阳性发生的概率。本发明的酵母重组系统大大提高了鉴定或检测具有内分泌破坏活性化学品的特异性。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 长牡蛎 重组表达质粒 诱饵质粒 重组系统 酵母 雌激素受体基因 卵黄蛋白原基因 海洋环境监测 阳性克隆菌株 环境雌激素 活性化学品 报告基因 酵母宿主 酵母细胞 筛选培养 生物毒性 重组酵母 干扰物 共转化 假阳性 内分泌 能力强 种检测 固着 菌株 质粒 爪蟾 蓄积 污染物 概率 海洋 检测 | ||
【主权项】：
1.一种检测环境雌激素类干扰物的酵母重组系统，其特征是该酵母重组系统由以下方法构建：/n(1)构建重组表达质粒：所述的重组表达质粒是以生物体雌激素受体基因ER的cDNA序列为目的序列；/n利用Primer5.0软件设计引物，在引物两端添加特异性酶切位点，利用上述引物扩增靶基因保守区域片段；/n利用生物体性腺组织cDNA模板及高保真酶进行PCR反应，胶回收纯化获得插入目的片段；/n选择载体pGADT7，该载体的筛选标志为Leu，使用该载体的目的是用于表达酵母转录因子DNA-AD，而表达DNA-AD之后可以启动酵母下游基因进行转录；/n利用限制性内切酶线性化处理克隆载体pGADT7，利用凝胶电泳分离、纯化载体后，经必克隆反应连接上述目的序列，构建重组表达质粒；/n(2)构建重组诱饵质粒：所述的重组诱饵质粒以5’GGTCAnnnTGACC 3’为核心序列，人工合成爪蟾卵黄蛋白原基因雌激素效应元件ERE，/n为增强对下游靶基因的调控效果，设计两段完全重复的效应元件序列，每段效应元件序列如下：/nTATGAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAATCTAGAAGATCCAAAGTCAGGTCACAGTGACCTGATCAAACTGCA/n根据效应元件序列的特异性，选择用于插入的唯一酶切位点，并在效应元件序列的5’端和3’端分别加上限制性内切酶粘性末端序列，同时将5’端进行磷酸化处理；/n选择载体pGBKT7用于表达酵母转录因子DNA-BD，该载体的筛选标志为Trp，使用该载体的目的在于可以识别上游激活序列，并与之结合，利用限制性内切酶线性化处理克隆载体pGBKT7，利用凝胶电泳分离、纯化后，经必克隆反应连接上述目的片段，构建重组诱饵质粒；/n(3)酵母菌的转化：/n将重组表达质粒与诱饵质粒共转化入Y187感受态细胞中，筛选培养阳性克隆菌株后确定酵母重组系统构建成功；/n同时仅转染重组表达质粒入Y187感受态细胞中，筛选培养阳性克隆菌株后确定酵母阴性对照组构建成功；/n所述的酵母菌株是Y187，是一种带有营养缺陷筛选标记的菌株，含有报告基因U-半乳糖甘酶基因(Lac Z)。/n
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