[发明专利]一种基于CRISPR/Cas9系统对新疆野苹果基因多靶点定点突变的方法

摘要

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9系统对新疆野苹果基因多靶点定点突变的方法，该方法是由克隆MsPDS基因，对MsPDS基因的5个不同的外显子序列设计了sgRNA，并将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到pYLCRISPR/Cas9载体中去，转化新疆野苹果叶片外植体，获得定点编辑的愈伤组织及不定芽步骤完成，针对新疆野苹果MsPDS基因的不同外显子序列，选择了5个不同的靶向位点，设计了5个sgRNA，再将sgRNA构建到pYLCRISPR/Cas9载体中去；再通过农杆菌介导的遗传转化，获得了目标基因定点突变的愈伤组织和不定芽，产生了白化的性状。该方法操作简单，实验周期短，可利用CRISPR/Cas9系统对不同的单基因的多位点或多个基因的不同位点进行定点的改造，为新疆野苹果基因功能研究提供了新的方法和思路。

主权项

1.一种基于CRISPR/Cas9系统对新疆野苹果MsPDS基因多靶点定点突变的方法，其特征在于该方法是由克隆MsPDS基因，对MsPDS基因的5个不同的外显子序列设计了sgRNA，并将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到pYLCRISPR/Cas9载体中去，转化新疆野苹果叶片外植体，获得定点编辑的愈伤组织及不定芽步骤完成，具体操作按下列步骤进行：克隆MsPDS基因：a、首先通过两对引物Ms‑PDS‑F1，Ms‑PDS‑R1；Ms‑PDS‑F2，Ms‑PDS‑R2扩增得到了MsPDS基因的大部分全长，共5232bp，包含有9个外显子；对MsPDS基因的5个不同的外显子序列设计sgRNA：b、在MsPDS基因第3、4、5、6号外显子的序列选择了A、B、C、D、E 5个不同的靶位点，设计了5个不同的sgRNA，分别命名为sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，sgRNA5；并针对不同的sgRNA序列设计了5对用于构建pYLCRISPR/Cas9载体的引物；构建以双靶点为例的多靶点pYLCRISPR/Cas9载体：c、将5种sgRNA以sgRNA1 & sgRNA2， gRNA1 & sgRNA3，sgRNA3 & sgRNA4，sgRNA1 & sgRNA5，两两不同的组合方式，分别构建了4种双靶点的pYLCRISPR/Cas9载体；转化根癌农杆菌EHA105：d、将构建好的4种不同pYLCRISPR/Cas9载体，以液氮冻融法转化根癌农杆菌EHA105；转化新疆野苹果叶片外植体：e、在步骤d得到的4种不同pYLCRISPR/Cas9的农杆菌分别浸染新疆野苹果叶片外植体2d前，准备叶片外植体，首先将新疆野苹果叶片去掉叶柄，用解剖刀垂直于中央叶脉横切，将叶片等分为上下两部分，以远轴面接触培养基的方式接种到诱导再生培养基，其中从叶片接种到诱导再生培养基开始，黑暗3周，其后以光照16h/d，光照强度2000Lx进行培养，培养温度为24±1℃；f、将带有4种不同pYLCRISPR/Cas9载体的农杆菌菌株EHA105，在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的固体LB培养基上划线，温度28℃倒置培养36h；g、在50ml的离心管里加入5ml LB培养基，同时加入50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，取平板上的单菌落，温度28℃，180rpm培养24h；h、将摇好的农杆菌菌液按照1:100的接菌量，接入到新的含有50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平液体的LB培养基中，扩大培养；5h后，检测菌液浓度；当OD₆₀₀为0.6‑0.8时， 3000g×10min，收集菌体，收集的菌体用农杆菌浸染液重悬至OD₆₀₀约0.6，然后温度28℃活化1h，100rpm；i、每25ml浸染液中放入步骤e中的已经培养2d的50片叶片外植体，室温下以40rpm轻微震荡培养20‑25min，然后用无菌的滤纸吸干叶片外植体表面的菌液，将叶片外植体再次放入诱导再生培养基与农杆菌共培养2d；j、共培养结束后，用无菌滤纸吸干叶片外植体上多余生长的农杆菌，叶片外植体转移至延迟筛选培养基；k、延迟筛选培养2d后，将叶片转移至筛选抑菌培养基中培养，每30d更换一次培养基，直至愈伤组织和不定芽的再生。