[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽-1的方法在审
| 申请号： | 201910168449.1 | 申请日： | 2019-03-06 |
| 公开（公告）号： | CN109868281A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 袁国跃;袁婧;屠志刚;郭畅;杨玲;赵志聪;李昊翔;徐梦娇;丁艺 | 申请（专利权）人： | 江苏大学附属医院 |
| 主分类号： | C12N15/75 | 分类号： | C12N15/75;C12N1/21;C07K14/605;C12R1/125 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 楼高潮 |
| 地址： | 212001 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽‑1的方法。首先化学合成得到含有BamHⅠ/XbaⅠ酶切位点及His‑tag标签的重组胰高血糖素样肽‑1目的基因片段，插入带有SamyQ信号肽序列的pHT43载体质粒中，经大肠杆菌DH5α扩增后，筛选阳性克隆，经过测序验证后，将测序正确的质粒大量抽提，经过电转化方法导入枯草芽孢杆菌WB800N宿主中，培养并且经过1mM IPTG诱导表达后，发酵液上清经过Tricine–SDS‑PAGE及Western Blot方法证明重组胰高血糖素样肽‑1（hmGLP‑1）的重组蛋白成功获得表达。本发明通过重组胰高血糖素样肽‑1基因导入肠道益生菌枯草芽孢杆菌中，使之成为能够表达其蛋白的重组菌，为后续制备活菌制剂和进行动物模型实验奠定基础。 | ||
| 搜索关键词： | 胰高血糖素样肽 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌DH5 α 测序 动物模型实验 宿主 肠道益生菌 信号肽序列 化学合成 活菌制剂 酶切位点 目的基因 阳性克隆 载体质粒 重组蛋白 电转化 发酵液 重组菌 抽提 扩增 质粒 制备 蛋白 验证 筛选 基因 成功 | ||
【主权项】：
1.一种利用枯草芽孢杆菌表达重组胰高血糖素样肽‑1的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）选取人胰高血糖素样肽‑1，将其氨基酸序列中2号位丙氨酸替换成丝氨酸，26号和34号位点的赖氨酸替换成谷氨酸和天冬氨酸，得到化学合成目的基因片段重组胰高血糖素样肽‑1，然后合成重组pHT43‑hmGLP‑1质粒；2）将重组质粒转入大肠杆菌DH5α超级感受态，抗性筛选重组质粒，并扩增提取；3）制备枯草芽孢杆菌感受态细胞，电转化培养单克隆菌落；4）将单克隆菌落接种到培养基上面，置于摇床中过夜培养，收集菌液，以F1/R1为引物进行PCR扩增；5）重组枯草芽孢杆菌的鉴定及目的蛋白分泌表达。
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