[发明专利]一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1

摘要

一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW‑1，属于基因工程技术领域，其特征在于：首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着设计最优靶向Egr1的干扰片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW‑1，转染A549/DDP细胞后，通过qRT‑PCR、Western blot和流式细胞仪检测，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达也随之降低，转染pZSW‑1实验组细胞内Rho‑123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著，MRP 1外排能力显著下降；说明沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。

主权项

1.一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW‑1，其特征在于：一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW‑1，首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人NM号为001964.2的Egr1基因的mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT‑H1.1/Shuttle‑RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1‑3，以pRNAT‑H1.1/Shuttle‑RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火，使其形成双链片段，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW‑1；转染A549/DDP细胞后，通过qRT‑PCR检测Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测Egr 1和MRP1蛋白表达水平，用流式细胞仪检测Rho‑123药物外排，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达降低，细胞内Rho‑123荧光强度高于对照组2.23倍，MRP 1外排能力显著下降；说明沉默Egr1基因，细胞对Rho‑123外排的能力降低，沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。