[发明专利]一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1

说明书

一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW‑1，属于基因工程技术领域，其特征在于：首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着设计最优靶向Egr1的干扰片段，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW‑1，转染A549/DDP细胞后，通过qRT‑PCR、Western blot和流式细胞仪检测，结果显示，干扰Egr1后，MRP 1基因表达也随之降低，转染pZSW‑1实验组细胞内Rho‑123荧光强度高于对照组2.23倍，差异显著，MRP 1外排能力显著下降；说明沉默Egr 1基因的表达有助于逆转肺癌细胞的耐药性。

技术领域

本发明涉及一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1，属于基因工程技术领域。

背景技术

癌症严重威胁着人类健康，癌细胞的产生是由于人体内原癌基因和抑癌基因受多种因素刺激，导致表达失衡，引起正常细胞的癌变。2018年国家癌症中心数据显示，肺癌是发病率和死亡率较高的肿瘤疾病之一，每年新发病例约为50万例。药物化疗是治疗肿瘤疾病常用的手段之一，但长时间的化疗使肺癌细胞产生耐药性，导致其治疗效率降低(郑佳彬，2017)。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗癌药物产生耐药性，同时对多种结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物产生的交叉耐药现象，其作用机制复杂。研究表明，多药耐药相关蛋白1(MRP 1)基因的过表达是肿瘤细胞产生耐药性的重要机制之一(Cole S P C，2014)。下调MRP 1蛋白表达，将有助提高肿瘤细胞对药物的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药现象。早期生长反应-1(early growth response,Egr 1)是一种重要的核转录因子(Karthikkeyan Gand Nagaraj N R，2018)，在调控细胞的生长、分化、发育、增殖等方面发挥着重要的作用。Egr 1基因在绝大多数的肿瘤细胞中均有表达，参与了从肿瘤形成、增殖分化到凋亡的全过程(林芳，2010)。Egr1是DNA结构域含有3个Cyc2-His2锌指结构的转录因子(韩雷，2007)，在锌离子存在的条件下，锌指结构与DNA序列中富含GC区结合，发挥转录调控作用。因此，Egr1可作为转录因子调控诸多靶基因的表达。大量研究证实，Egr 1与靶基因上特异地结合位点作用调节细胞发挥各种生物学功能。肿瘤细胞中某些基因的突变可能促使Egr1表达升高，对于这些肿瘤细胞来说，Egr1基因的高表达与肿瘤的发生、发展有关，并可能起到促肿瘤的作用。因此如何发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1成为急需解决的一大难题，所以通过首先复苏和培养A549/DDP细胞，接着根据NCBI中人Egr1基因(NM_001964.2)mRNA序列，按照RNAi设计原则，设计最优靶向Egr1的干扰片段；正向序列和反向序列之间以序列为CGAA的Loop环连接，反向序列后连接终止序列TTTTTT；分析质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP的多克隆位点，在5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上HindⅢ酶切位点，经NCBI Blast比对同源性确定与其他基因无同源性，送至上海生工合成，命名为shEgr1-3，以pRNAT-H1.1/Shuttle-RFP空载质粒为无关序列作为对照组；shRNA的退火，使其形成双链片段，构建靶向Egr 1的shRNA干扰表达载体，命名为pZSW-1。利用shRNA干扰表达载体转染A549/DDP细胞，通过qRT-PCR检测RNAi后的Egr1和MRP1基因mRNA的表达水平，通过Western blot检测RNAi后的Egr 1和MRP1蛋白表达水平，用流式细胞仪检测Rho-123药物外排，发明一种通过RNAi沉默Egr1基因降低肺癌细胞多药耐药性的载体pZSW-1是必要的。

发明内容