[发明专利]人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体制备方法

摘要

本发明提供一种人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体的制备方法，其方法是将人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3插入PGEX‑4T‑1载体，获得PGEX‑4T‑1‑SKA3原核表达载体；再通过PCR获得融合片段GST‑SKA3并插入pCMV‑HA载体，获得带HA及GST标签的SKA3真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3；培养转染了该真核表达载体的喉鳞状癌细胞Hep‑2，然后纯化获得重组GST融合蛋白。具体包括如下步骤：(1)原核表达载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的构建与验证；(2)真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3的构建与验证；(3)喉鳞状细胞癌Hep‑2细胞中真核表达及纯化。本发明选择GST标签可提高蛋白表达的可溶性和表达量；利用真核表达载体pCMV‑HA表达蛋白，表达时形成稳定的二硫键，对表达的蛋白进行正确折叠，并进行复杂糖基化修饰，蛋白活性接近于天然蛋白，不需去除内毒素。

主权项

1.人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3真核表达蛋白质单体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的构建与验证(1)根据人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列设计并合成引物(a)根据NCBI数据库人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列信息，利用软件Primer Premier 5设计并合成引物；(b)为了便于插入PGEX‑4T‑1载体，在两端引物分别引入了EcoR I和Not I的酶切位点；(2)载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的构建(a)以喉鳞状癌细胞Hep‑2的cDNA为模板，以Pfu酶通过PCR扩增SKA3基因序列全长并引入酶切位点EcoR I和Not I；(b)使用EcoR I、Not I双酶切SKA3的PCR产物，所得产物经胶回收纯化后与同样使用EcoR I、Not I双酶切的PGEX‑4T‑1载体质粒连接；(c)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；(d)挑取单克隆、无内毒素提取验证载体PGEX‑4T‑1‑SKA3质粒，使用EcoR I、Not I双酶切载体PGEX‑4T‑1‑SKA3质粒，核酸电泳验证，筛选阳性单克隆，获得原核表达载体PGEX‑4T‑1‑SKA3；(3)载体PGEX‑4T‑1‑SKA3的验证将阳性单克隆载体PGEX‑4T‑1‑SKA3质粒送测序，检测SKA3的序列情况，验证与所选的人喉鳞状细胞癌相关基因SKA3的序列信息一致；(二)真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3的构建与验证(1)根据PGEX‑4T‑1‑SKA3载体序列设计并合成引物(a)为了携带GST标签，根据PGEX‑4T‑1‑SKA3载体的序列信息，利用软件Primer Premier 5设计并合成引物；(b)为了便于插入pCMV‑HA真核表达载体，在两端引物分别引入了Xho I和Not I的酶切位点；(2)真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3的构建(a)以原核表达载体PGEX‑4T‑1‑SKA3为模板，以Pfu酶通过PCR获得带Xho I和Not I酶切位点的GST‑SKA3融合片段；(b)使用Xho I、Not I双酶切GST‑SKA3的PCR产物，所得产物经胶回收纯化后与同样使用Xho I、Not I双酶切的pCMV‑HA载体连接；(c)将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中；(d)挑取单克隆、无内毒素提取验证载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3质粒，使用Xho I、NotI双酶切载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3质粒，核酸电泳验证，筛选阳性单克隆，获得真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3；(3)真核表达载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3的验证将阳性单克隆载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3质粒送测序，检测GST‑SKA3融合片段的序列情况，验证与PGEX‑4T‑1‑SKA3载体的GST‑SKA3序列信息一致；(三)喉鳞状细胞癌Hep‑2细胞中真核表达及纯化(1)接种测序正确的pCMV‑HA‑GST‑SKA3菌液到LB液体培养基扩大培养；(2)提取pCMV‑HA‑GST‑SKA3质粒，使用转染试剂进行载体pCMV‑HA‑GST‑SKA3质粒转染喉鳞状细胞癌Hep‑2细胞，真核表达重组GST融合蛋白；(3)提取总蛋白，用HA抗体检测重组GST融合蛋白；(4)利用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化重组GST融合蛋白。