[发明专利]一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法在审
| 申请号： | 201910086730.0 | 申请日： | 2019-01-29 |
| 公开（公告）号： | CN109735519A | 公开（公告）日： | 2019-05-10 |
| 发明（设计）人： | 任晋东;卢立志;刘小林;俞奇力;刘雅丽;付永前;王文基;沈建良;杨福生 | 申请（专利权）人： | 台州学院;浙江省农业科学院;西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N9/36 | 分类号： | C12N9/36;C12N15/85;C12N15/88 |
| 代理公司： | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) 11531 | 代理人： | 李宏伟 |
| 地址： | 318000 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，该方法包括以下步骤：将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；构建基因编辑模板ssDNA，该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA；将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液，并将混合液与脂质体混合抚育、注射到囊胚附近孵化，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。本发明方法具有技术可靠，永久及安全高效表达的特点，溶菌酶的翻译量提高了近百倍。 | ||
| 搜索关键词： | 溶菌酶 质粒 基因 利用基因 同源序列 互补链 混合液 启动子 靶点 禽蛋 启动子区域 溶菌酶基因 脂质体混合 转录 雌性家禽 高效表达 互补序列 卵清蛋白 质粒载体 剪切 靶向 构建 囊胚 线状 抚育 注射 克隆 孵化 翻译 安全 | ||
【主权项】：
1.一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；(2)构建基因编辑模板ssDNA，该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA；(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液，并将混合液与脂质体混合抚育；(4)在体外孵化禽胚蛋的胚盘附近加入脂质体抚育后，把步骤(3)中抚育后的混合液注射到开始发育的囊胚附近，将整个胚蛋移至体外容器，加入双抗后用密封、孵化，在形成个体后对插入的片段进行验证筛选，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。
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