[发明专利]苜蓿品种专一性共生根瘤菌的筛选方法

摘要

本发明公开了苜蓿品种专一性共生根瘤菌的筛选方法，是从苜蓿品种植株及根际土壤分离的根瘤菌株，通过苜蓿品种与根瘤菌株结瘤的效应检测，筛选出苜蓿品种与根瘤菌株专一高效共生的正效应组合。本发明选取的根瘤菌来自苜蓿植株及根际土壤，同一生长环境，匹配适应性强；苜蓿品种与根瘤菌株共生效应指标筛选，简单有效，易于操作；此方法将苜蓿品种与根瘤菌的共生效应分为专一性共生“正效应”、共生“无效应”和专一性共生“负效应”，精准利用专一性共生“正效应”，抑制或克服专一性共生“负效应”，对苜蓿品种与根瘤菌结瘤效应的精准利用具有重要的指导意义。

主权项

1.苜蓿品种专一性共生根瘤菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)培育幼苗：挑选子粒饱满、健康的紫花苜蓿品种种子数粒，在生物安全柜内用有效碘含量0.45％～0.55％W·V‑1的碘伏溶液，震荡灭菌3min，用无菌水冲洗5～6次，于清水琼脂中28℃催芽48h；将河沙洗净，过2‑mm筛，pH调至中性后105℃烘干，121℃灭菌6h，冷却；在直径13.2cm、高10cm的塑料盆中装入河沙450g，并均匀植入60粒种子发芽，深度为2cm；之后将塑料小盆放入29cm×20cm×9.5cm的塑料面盆中，每个面盆内放2个小盆，并浇灌500mL灭菌水；培养条件为：光照时间12h·d‑1，有光照时温度21～25℃，无光照时温度16～20℃，相对湿度45±5％；在第7d浇灌500mL Hoagland有氮营养液；2)制备菌液：将根瘤菌株TY平板活化后转接入50mL TY液体培养基，28℃、180rpm·min‑1振荡培养至菌液光密度OD600nm值为0.5～1，4000rpm·min‑1离心5min，抛去上清液后用等体积的无菌水冲洗菌体，并用涡旋振荡器将其打散，最后用无菌水调制成OD600nm为0.5的根瘤菌液；3)接种根瘤菌株：在幼苗生长至第15d左右，即第1片真叶出现时，用移液器将制备好的菌液加入幼苗根部，每小盆30mL，以不含根瘤菌的TY液体培养基为对照；每个菌株处理4个小盆作为重复；接种后每隔7d在塑料面盆中浇灌Hoagland无氮营养液500mL；其余时间水分用灭菌蒸馏水补充；4)测定指标：将测试的所有根瘤菌株浇灌接种紫花苜蓿品种，接种45d后，即植株已生长60d左右，收获紫花苜蓿植株并清洗干净，用滤纸吸干水分；每盆随机选取10株，测定单株结瘤数、有效根瘤重、根瘤直径、根瘤等级、固氮酶活性、单株叶片数、株高、根长、地上鲜重、地下鲜重、地上干重、地下干重、叶绿素含量和粗蛋白含量；5)筛选共生效应代表性指标：对步骤4)测定的14个指标进行主成分分析，选择第一主成分中贡献率最大的指标，代表根瘤菌株与紫花苜蓿品种的共生效应；6)共生效应分类：当根瘤菌株接种紫花苜蓿品种的共生效应指标值显著高于未接种处理CK时(P<0.05)，表明根瘤菌株与苜蓿品种植株共生产生正效应，标记为“正效应”；当根瘤菌株接种紫花苜蓿品种的共生效应指标值与CK差异不显著时(P>0.05)，标记为“无效应”，表明根瘤菌株与苜蓿品种植株共生不产生效应；当根瘤菌株接种紫花苜蓿品种的共生效应指标值显著低于CK时(P<0.05)，标记为“负效应”，表明根瘤菌株与苜蓿品种植株共生产生负效应。7)专一性共生根瘤菌株的确定：根瘤菌株与紫花苜蓿品种共生效应标记为“正效应”的根瘤菌株，确定为该紫花苜蓿品种的专一性结瘤正效应菌株；标记为“负效应”的根瘤菌株，确定为该紫花苜蓿品种的专一性结瘤负效应菌株；标记为“无效应”的根瘤菌株，确定为该紫花苜蓿品种的共生结瘤无效应菌株。