[发明专利]一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201811481106.2 | 申请日： | 2018-12-05 |
| 公开（公告）号： | CN109652451A | 公开（公告）日： | 2019-04-19 |
| 发明（设计）人： | 王桂军;刘光清;周晓雅;周祺;邢雪;许泽军;顾香雪;黄荣 | 申请（专利权）人： | 安徽农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10;C12N15/54;C12R1/91 |
| 代理公司： | 合肥兴东知识产权代理有限公司 34148 | 代理人： | 姜玲燕 |
| 地址： | 230036 安徽*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | 本发明公开了1.一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，大致步骤如下：1)重组质粒构建；2)慢病毒样颗粒的制备；3)hTERT基因的细胞系构建和筛选；4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测；5)hETRT蛋白表达检测。本发明构建方法有利于改善目前细胞系匮乏的研究现状，有利于资源的推广使用。绵羊羊睾丸永生化细胞系的建立减少了实验动物的使用量，提供了一种更为稳定的实验研究对象。 | ||
| 搜索关键词： | 羊睾丸 构建 绵羊 细胞永生化 蛋白表达检测 实验研究对象 重组质粒构建 细胞系构建 实验动物 慢病毒 永生化 制备 筛选 检测 应用 研究 | ||
【主权项】：
1.一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：1)重组质粒构建：根据人的端粒酶的全基因序列设计一对扩增hTERT基因PCR特异性引物，将扩增的hTERT基因重组转载到重组质粒pLOV‑CMV上，获得重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT；2)慢病毒样颗粒的制备：对步骤1)重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT，将无内毒素的重组质粒pLOV‑CMV‑hTERT、包装质粒pSPAX2以及外膜质粒pMD2.G质粒用转染试剂共转染到293T细胞中，转染30h收集细胞上清液，并置于‑80℃保存；3)表达hTERT基因的细胞系构建和筛选：用步骤2)中慢病毒样颗粒的细胞培养上清液感染绵羊睾丸细胞，用嘌呤霉素培养基进行筛选；4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测：提取步骤3)筛选后细胞系的总DNA和总RNA，用PCR检测hTERT基因表达，用RT‑PCR方法检测hTERT基因的mRNA转录水平；5)hETRT蛋白表达检测：取步骤3)细胞系的细胞进行Western blotting检测和间接免疫荧光检测，以鉴定hTERT蛋白的表达。
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