[发明专利]新疆伊犁株马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体制备方法

摘要

本发明涉及细胞工程领域，特别是新疆伊犁株马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体制备方法，（1）从含有新疆伊犁马驽巴贝斯虫Bc48重组质粒的大肠杆菌中纯化HIS‑Bc48重组蛋白；（2）取健康6~8周龄BALB/c小鼠若干只，选37℃且5％的CO2效价在10⁵以上的小鼠在融合前3天腹腔注射100μg重组蛋白加强免疫；（3）无菌对小鼠脾脏局部进行提取、融合及培养；(4)用包被HIS‑Bc48蛋白的间接ELISA及Bc48转染293T细胞的间接免疫荧光方法进行筛选，选择其中的阳性株进行亚克隆，4~5次亚克隆后，即可获得稳定分泌马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明为今后建立快速的诊断方法，和该蛋白功能的深入研究提供工具。

主权项

1.一种新疆伊犁株马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体制备方法，其特征是：（1）从含有新疆伊犁马驽巴贝斯虫Bc48重组质粒的大肠杆菌中纯化HIS‑Bc48重组蛋白，使用蛋白含量测定仪测定其蛋白浓度，在﹣80℃保存备用；（2）取健康6~8周龄BALB/c小鼠若干只，在其背部皮下多点注射免疫纯化的HIS‑Bc48重组蛋白，HIS‑Bc48重组蛋白是剂量为100μg/只且二免和三免免疫相同剂量的抗原；将小鼠免疫间隔2周，三免后10天尾尖采血测试抗体效价，选37℃且 5％ 的CO₂效价在10⁵以上的小鼠在融合前3天腹腔注射100μg重组蛋白加强免疫；（3）无菌对小鼠脾脏局部进行提取，将从中提取出的小鼠脾脏新鲜样本制成脾细胞，使脾细胞和骨髓瘤细胞按5:1 ~ 10:1的质量比混合于一支离心管中，加入1 ml 体积分数为50%的聚乙二醇进行融合，用含有15%胎牛血清的1640培养液重悬细胞，加至96孔细胞培养板中，每孔100μl，将培养板放到 37℃且 5％ 的CO₂ 培养箱内培养，在融合第 2 天，添加 1% HAT 培养液，每孔 100μl，放入37℃且 5％ 的CO₂ 培养箱中培养；(4) 在培养5~7天后，HAT培养基全换液一次，4~5天后，吸取培养液，用包被HIS‑Bc48蛋白的间接ELISA及Bc48转染293T细胞的间接免疫荧光方法进行筛选，选择其中的阳性株进行亚克隆，4~5次亚克隆后，即可获得稳定分泌马驽巴贝斯虫Bc48蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。