[发明专利]一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法

摘要

本发明属于细胞培养技术领域，一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，包括以下步骤：(1)灌流液经肝门静脉原位灌注，(2)消化液经肝门静脉原位灌注，(3)肝脏离体，撕碎包膜，过筛获得包含多种肝原代的细胞悬液，(4)获得的细胞悬液常规离心，获得实质细胞和收集的上清液，(5)上清液经密度梯度离心分离出星状细胞和剩余下层细胞悬液，(6)剩余下层细胞悬液分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育，经磁场分选后分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞。肝原代细胞分离后，立即重悬于对应的专门配制的培养基中培养。本发明细胞得率高，分离效果好，为体外构建多细胞肝脏模型提供了稳定的细胞来源。

主权项

1.一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1、将啮齿动物麻醉后，开腹，使用留置针肝门静脉插管，灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌注5‑30min，灌流速度为5‑25mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡，所述灌流液选自额外添加终浓度为0.5‑10mM EGTA和1‑50mM HEPES的缓冲液，所述缓冲液选自不含Ca2+，Mg2+的HBSS或D‑Hanks或PBS中的一种；步骤2、替换灌流液，将消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌注2‑15min，灌流速度为5‑20mL/min，所述消化液选自额外添加终浓度为50‑300mg/L CaCl2、1‑50mM HEPES、10‑100mg/L胶原酶、0‑100U/mL青霉素和0‑100U/mL链霉素的基础培养基，所述胶原酶选自Ⅱ型或Ⅳ型胶原酶中的一种，所述基础培养基选自市售的DMEM‑高糖，DMEM‑低糖或1640中的一种；步骤3、将步骤2中消化后的肝脏小心取出置于盛有分离液的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并过筛，所述分离液选自额外添加终浓度为0.05‑5μM地塞米松和2％‑10％FBS的基础培养基，所述基础培养基选自市售的DMEM‑高糖、DMEM‑低糖或1640中的一种，所述过筛选自孔径为20‑200μm的组织筛或纱布中的一种；步骤4、将步骤3制得的细胞悬液加入离心管中，500‑800rmp/min离心1‑5min后，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500‑800rmp/min离心1‑5min后，获得实质细胞，再将实质细胞立即重悬于专门配制的实质细胞培养基中培养，所述专门配制的实质细胞培养基选自额外添加终浓度为2％‑10％FBS、0‑100U/mL青霉素、0‑100U/mL链霉素、1‑10mM L‑谷氨酰胺和10‑100nM地塞米松的Williams E培养基；步骤5、向50mL的离心管中加入10‑20mL浓度为20％‑50％的percoll溶液，再加入5‑15mL浓度为10％‑20％的percoll溶液，最后加入10‑20ml步骤4中获取的上清液，之后1500‑2000rmp/min离心10‑20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，立即重悬于专门配制的星状细胞培养基中培养，下层界面中的细胞悬液经1000‑3000rmp/min离心15‑20min，用分离液重悬，平均分成两份备用，所述专门配制的星状细胞培养基选自额外添加终浓度为2％‑10％FBS、0‑100U/mL青霉素、0‑100U/mL链霉素和1‑10mM L‑谷氨酰胺的DMEM培养基；步骤6、将步骤5中所制备的两份备用细胞悬液100‑1000rmp/min离心2‑8min后，之后重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育0.5‑5h，缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后100‑1000rmp/min离心1‑10min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即重悬于对应的专门配制的培养基中培养，专门配制的肝血窦内皮细胞培养基选自额外添加终浓度为2％‑10％FBS，0‑100U/mL青霉素、0‑100U/mL链霉素、1‑10mM L‑谷氨酰胺、10‑100nM地塞米松和1‑50ng/mL VEGF的1640培养基，专门配制的枯否细胞培养基选自额外添加终浓度为2％‑10％FBS、0‑100U/mL青霉素、0‑100U/mL链霉素和1‑10mM L‑谷氨酰胺的1640培养基，所述肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠选自市售的Anti‑CD146或Anti‑CD31抗体偶联磁珠中的一种，所述枯否细胞特异性的免疫磁珠选自市售的Anti‑CD14、Anti‑GFAP或Anti‑F4/80抗体偶联磁珠中的一种；提取、分离后的4种肝原代细胞是放置在温度为37℃，CO2含量为5％，湿度为95％的细胞培养箱中培养。