[发明专利]一种三维肾小球模型的制备方法

摘要

本发明涉及一种三维肾小球模型的制备方法，属于生物技术领域。尤其涉及一种具有仿生肾小球三维结构的微流控的体外肾小球模型的制备和仿生肾小球功能模拟。本发明制备的三维肾小球模型，能够模拟多种仿肾小球的三维结构微环境，如肾小球球状结构、血管状通道和可模拟卷曲微血管表面结构的微凸起结构等。本发明制备方法中涉及了基于微流控的有纺锤型结节的中空凝胶纤维制备方法、凝胶表面微凸起结构的制备方法和稳定可控的凝胶材料流通装置搭建方法，并结合细胞共培养技术，成功构建了具有一定的仿生肾小球屏障功能的三维肾小球模型。本发明制备的三维肾小球模型可作为构建高通量的肾脏药物筛选/疾病模型的研究平台。

主权项

1.一种三维肾小球模型的制备方法，其特征在于该制备方法包括以下步骤：(1)制备含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维，过程如下：(1‑1)搭建一个凝胶纤维制备系统，该制备系统包括一个共轴微流控装置(1)、一个旋转装置(2)和一个水池(3)，所述的水池(3)中盛有摩尔浓度为0.1‑0.2摩尔/升的氯化钙溶液(5)，所述的共轴微流控装置(1)垂直固定在氯化钙溶液(5)的上方，共轴微流控装置(1)的底端与氯化钙溶液面的距离为0.5‑2毫米，旋转装置(2)位于氯化钙溶液(5)的上方、盛放氯化钙溶液(5)的水池(3)的一侧，旋转装置(2)的旋转面垂直于氯化钙溶液面，共轴微流控装置(1)下方、水池3底部的侧面设置一个旋转轴(6)；(1‑2)制备碳酸钙颗粒与海藻酸钠溶液的混合液，混合液中，碳酸钙颗粒的质量体积浓度为0.1‑0.2克/毫升，海藻酸钠溶液的质量体积浓度为1％‑3％w/v；(1‑3)向共轴微流控装置(1)的内层入口(8)引入摩尔浓度为0.1‑0.2摩尔/升的氯化钙溶液，流速为5‑30微升/分钟；向共轴微流控装置1的外层入口(9)引入步骤(1‑2)的混合液，流速为40‑100微升/分钟；内层溶液和外层溶液在共轴微流控装置(1)的出口通道(7)中形成层流，层流界面发生交联反应形成凝胶纤维；将共轴微流控装置(1)的出口生成的纤维牵引至旋转轴(6)，使纤维经过旋转轴(6)后通过旋转装置(2)进行收集，得到含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维4；(2)在步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)的纺锤型结节表面上制备微凸起结构：将步骤(1)制备的含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)放入10％‑30％的盐酸溶液中10‑30秒，含碳酸钙的有纺锤型结节的中空凝胶纤维(4)中的碳酸钙与盐酸反应，生成二氧化碳气体，使纺锤型结节表面形成微凸起结构，得到结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)，将该结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)在去离子水中清洗数次后，保持于去离子水中并放入真空干燥箱中抽真空，除气，最后将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)放入摩尔浓度为0.1‑0.2摩尔/升的氯化钙溶液中保存备用；(3)将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)组装到流通装置：该流通装置包括底板(10)和无底孔板(11)，所述的无底孔板(11)上开有三个通孔(12)，所述的底板(10)上开有三个凹槽(13)，三个凹槽(13)的深度与含有微米级中空通道凝胶材料(15)的出入口处厚度相等，三个凹槽(13)之间通过微通道(14)相互连接；所述的底板(10)和无底孔板(11)相对固定，无底孔板(11)上的通孔(12)与底板(10)上的凹槽(13)位置相对；在底板(10)的微通道(14)中加入聚二甲基硅氧烷预聚物，在凹槽(13)中加入去离子水或氯化钙溶液；将结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)放入底板(10)中，如图5所示，使结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的两端处于微通道(14)中；在无底孔板(11)的底部涂抹聚二甲基硅氧烷预聚物，将所述已装有结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的底板(10)与无底孔板(11)对接组装，并用夹子将二者夹紧；在流通装置的各孔中加满去离子水或氯化钙溶液，随后把整个流通装置放入烘箱中烘烤1‑3小时使聚二甲基硅氧烷预聚物聚合交联；将组装在流通装置中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的两端多余的部分剪去，从而保证通道出入口处于开放状态，即得到装载有凝胶纤维的流通装置；(4)利用步骤(3)制备的装载有凝胶纤维的流通装置，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的外表面制备肾小球足细胞屏障，包括以下步骤：(4‑1)配置第一肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清和干扰素，使得胎牛血清的体积浓度为10％，干扰素的浓度为10U/毫升；配置第二肾小球足细胞培养基：在杜尔伯科改良伊格尔/F12培养基中加入胎牛血清，使得胎牛血清的体积浓度为10％；(4‑2)对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌和孵育预处理：除去步骤(3)中制备的装载有凝胶纤维的流通装置中的液体，在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔内加入浓度为75％的乙醇，浸泡24小时，以对装载有凝胶纤维的流通装置进行灭菌处理，随后将装载有凝胶纤维的流通装置中的乙醇除去，用去离子水清洗3‑5次，在装载有凝胶纤维的流通装置各孔中加入含有0.005摩尔/升氯化钙的第一肾小球足细胞培养基，孵育4‑10小时；(4‑3)制备足细胞悬浮液：将肾小球足细胞放入第一肾小球足细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、33℃条件下培养，每2天更换一次第一肾小球足细胞培养基，当培养的肾小球足细胞密度为70％‑80％时，除去第一肾小球足细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗肾小球足细胞两次，加入质量浓度为0.05％‑0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在肾小球足细胞上，在37℃保持1‑3分钟；向肾小球足细胞中再加入第一肾小球足细胞培养基，第一肾小球足细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2‑3倍，晃动数次，使肾小球足细胞脱离容器而悬浮于第一肾小球足细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一肾小球足细胞悬浮液；对第一肾小球足细胞悬浮液进行离心处理，转速为700‑1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升第一肾小球足细胞培养基，得到第二肾小球足细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二肾小球足细胞悬浮液中肾小球足细胞密度，并计算肾小球足细胞数目，再以700‑1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入第一肾小球足细胞培养基，使细胞密度为4‑8×106个/毫升，得到第三肾小球足细胞悬浮液；(4‑4)制备肾小球足细胞屏障：吸除装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中的液体，向装载有凝胶纤维的流通装置的中间孔中的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)上加入30微升步骤(4‑3)中制备的第三肾小球足细胞悬浮液，使装载有凝胶纤维的流通装置倒置，在体积浓度为5％的二氧化碳氛围中、33℃下培养1‑2小时，当肾小球足细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的表面时，使得流通装置正置；再在装载有凝胶纤维的流通装置的各孔中加入第一肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％二氧化碳的氛围、33℃下培养，培养过程中每天更换第一肾小球足细胞培养基，培养1‑2周；当肾小球足细胞增殖并覆盖结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)表面时，将培养基更换为第二肾小球足细胞培养基，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、38℃下培养，每天更换第二肾小球足细胞培养基，肾小球足细胞将逐渐分化，在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)外表面上形成肾小球足细胞屏障；(5)在步骤(4)的结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面制备内皮细胞屏障，以得到三维肾小球模型，包括以下步骤：(5‑1)准备内皮细胞悬浮液：将内皮细胞放入内皮细胞培养基中，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃条件下培养，每2天更换一次内皮细胞培养基，当培养的内皮细胞密度为80％‑90％时，除去内皮细胞培养基，用磷酸盐缓冲液冲洗内皮细胞两次，加入质量浓度为0.05％‑0.25％的胰酶溶液，使胰酶溶液覆盖在内皮细胞上，在37℃保持1‑5分钟；向内皮细胞中再加入内皮细胞培养基，内皮细胞培养基的加入量为胰酶溶液的2‑3倍，晃动数次，使内皮细胞脱离容器而悬浮于内皮细胞培养基和胰酶的混合液中，得到第一内皮细胞悬浮液；对第一内皮细胞悬浮液进行离心处理，转速为700‑1500转/分钟，时间为5分钟，除去上清液，重新加入1毫升内皮细胞培养基，得到第二内皮细胞悬浮液；利用血球计数板测定第二内皮细胞悬浮液中内皮细胞密度，并计算内皮细胞数目，再以700‑1500转/分钟离心处理5分钟，除去上清液,再次加入内皮细胞培养基，使内皮细胞密度为25‑50×106个/毫升，得到第三内皮细胞悬浮液；(5‑2)制备内皮细胞屏障以得到三维肾小球模型：将装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内的培养基除去，各加入4‑10微升第三内皮细胞悬浮液，在体积浓度为5％的二氧化碳的氛围中、37℃下培养1‑2小时，当内皮细胞贴附在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面上时，再在装载有凝胶纤维的流通装置的两端孔内加入内皮细胞培养基，进行培养，每天分别更换装载有凝胶纤维的流通装置中两端孔内的内皮细胞培养基和中间孔内的第二肾小球足细胞培养基，4‑6天后，内皮细胞将长满结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面，形成内皮细胞屏障；从而在结节表面具有微凸起结构的中空凝胶纤维(15)的内表面和外表面分别形成内皮细胞屏障和肾小球足细胞屏障，得到三维肾小球模型。