[发明专利]一种甘蔗体细胞杂交的方法

摘要

本发明属于植物体细胞杂交技术领域，具体涉及一种甘蔗体细胞杂交的方法，包括以下步骤：(1)亲本原生质体的制备；(2)原生质体的钝化；(3)原生质体融合诱导物的添加：其中一种亲本原生质体一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种亲本原生质体等体积混合得到混合原生质体；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体进行电融合。本发明利用硅与植物细胞膜表面的糖脂具有很高的亲和力的原理，两种亲本原生质体在硅的诱导下融合，达到提高一对一融合率的作用，杂交后代同时具有ROC22甘蔗高产高糖、高耐旱性的基因，同时具有GT28甘蔗的高糖耐寒基因。

主权项

1.一种甘蔗体细胞杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备原生质体：分别选取ROC22甘蔗幼苗嫩叶和GT28甘蔗幼苗嫩叶作为亲本制备原生质体，分别得到ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I；(2)原生质体的钝化：步骤(1)中得到的ROC22甘蔗原生质体I和GT28甘蔗原生质体I的其中一种于室温下悬浮于5‑7mmol/L的IOA溶液中17‑22min，另一种于室温下悬浮于45‑55μg/mL的R‑6G溶液中17‑22min，得到ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II，接着将ROC22甘蔗原生质体II和GT28甘蔗原生质体II分别洗涤后置于黑暗条件下进行培养至密度为4×105‑6×105个/ml，得到ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III；(3)原生质体融合诱导物的添加：将步骤(2)得到的ROC22甘蔗原生质体III和GT28甘蔗原生质体III中的一种用硅酸盐水溶液培养后，与另一种等体积混合得到混合原生质体，其中，用硅酸盐水溶液培养的方法：取硅浓度为0.55‑0.75mg/L的硅酸盐水溶液，将ROC22甘蔗原生质体III或GT28甘蔗原生质体III置于硅酸盐水溶液中于常温下培养10‑15min后取出；(4)原生质体的融合：将步骤(3)得到的混合原生质体放入细胞融合仪装有融合液的融合小室中进行电融合，融合的参数为：交流场强为150‑250V·cm‑1、交流频率为450‑650kHz、持续时间100‑300s、直流脉冲场强为1.5‑2.5kV·cm‑1、脉冲宽度为30‑50μs以及脉冲次数1‑3个。