[发明专利]一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用

摘要

本发明公开了一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，包括以下步骤：(1)脐带羊膜组织的分离及冻存；(2)脐带血管组织的分离及冻存；(3)脐带华通氏胶组织的分离及冻存。本发明还提供了脐带的复苏方法。本发明的冻存方法，将脐带羊膜、血管、华通氏胶组织，按照结构层次依此剥离，再经过处理，放入液氮中冻存，分别保存脐带的三种组织，根据每种组织的特异性采取不同的冻存及复苏方法，有利于提高冻存复苏活性和细胞得率。本发明提供了一套系统的保存完整脐带各类组织的方法，为脐带来源的干细胞研究提供了重要的生物资源，可以用于组建脐带来源的组织或细胞资源样本库。本发明为完善脐带来源的人类遗传资源库奠定了坚实的基础和依据。

主权项

1.一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)脐带羊膜组织的分离及冻存：用生理盐水洗涤脐带，剪去脐带两头，再用生理盐水涮洗，撕取或剪下表面羊膜组织；用生理盐水冲洗羊膜组织，将羊膜折叠或平放于冻存袋中，加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心去除平衡液，然后加入预冷至4℃～10℃的玻璃化冻存液Ⅰ，转移至液氮冷冻保存；所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加15～25wt％的乙二醇，即得；所述玻璃化冻存液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加40～60wt％的甘油、10～20wt％的海藻糖、8～15wt％的1,2‑丙二醇，混匀，即得；所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α‑MEM培养基；(2)脐带血管组织的分离及冻存：将上述已经剥离羊膜的脐带的动脉血管和静脉血管分离下，用生理盐水清洗，并冲洗血管以去除血管内滞留血块，然后将血管剪成长2～4cm的小段；将血管小段转移至离存管中，加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心去除平衡液，再转移至冻存管中，加入预冷至4℃～10℃玻璃化冻存液Ⅱ，每1条血管小段加入1ml的玻璃化冻存液Ⅱ，分五步导入玻璃化冻存液；导入完成后快速封口，转移至液氮冷冻保存；所述玻璃化冻存液Ⅱ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2‑丙二醇，混匀，即得；(3)脐带华通氏胶组织的分离及冻存：用生理盐水充分洗涤上述剥离羊膜和血管的脐带，转移至离心管中，剪碎成1～2cm3的组织块；加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心，去除上清，再将组织块转移至冻存管中，加入预冷至4℃～10℃的玻璃化冻存液Ⅲ，转入程控降温仪，按照设定的降温程序降温至‑90℃，转移至液氮冷冻保存；所述玻璃化冻存液Ⅲ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜、8wt％的海藻糖、10wt％的1,2‑丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混匀，即得。