[发明专利]一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法

摘要

本发明属于动物组织分离和培养技术领域。具体涉及一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法。本发明在猪肠道隐窝分离的过程中加入青霉素和链霉素，避免了后期培养过程中由肠道微生物导致的污染，通过优化水平摇转仪处理肠段的转速和时间及涡旋仪涡旋的次数和时间，使获得的隐窝形态更完整，存活率和出芽率更高。本发明优化了用于隐窝和3D类器官培养的培养液的配方，使隐窝能更好地分化形成3D类器官并稳定地生长和分化。本发明确定了猪肠道隐窝的分离条件和最佳培养方法，为后续利用猪肠道3D类器官研究肠道病毒和细菌感染奠定了良好的基础。

主权项

1.一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法，其特征包括以下步骤：(1)猪肠道隐窝的分离：无菌采集仔猪空肠中段，洗涤后剥离浆膜，纵向剖开肠段，刮去绒毛，切成小块后用冷PBS缓冲液洗涤干净，转移至含10mmol/L EDTA和1mmol/L二硫苏糖醇的冷PBS缓冲液的平皿中，于水平摇转仪上振摇孵育后，将肠段转移至加有冷PBS缓冲液的离心管中，于涡旋仪上涡旋后吸弃上清，再加冷PBS缓冲液，于涡旋仪上涡旋后收集上清液，即为隐窝悬液；(2)猪肠道3D类器官的培养：将上步所得的隐窝悬液离心后弃上清，加入适量冷PBS缓冲液重悬后计数，计数完成后离心去上清，根据计数结果用合适体积的预冷的Matrigel胶重悬，铺于24孔板中，置于37℃培养箱中，待胶完全凝固后加入预热的含生长因子的DMEM/F12培养液，于37℃培养箱中继续培养，培养液每两天更换一次。