[发明专利]厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及其化学成分分析

摘要

本发明公开了一种瑶药厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位的体外筛选及其化学成分分析的方法，本发明是将厚叶南五味子经天然药物化学方法提取得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水层共4个溶剂提取物，采用CCK‑8法检测不同溶剂提取物对大鼠肝星状细胞HSC‑T6的增殖作用、ELISA法检测不同溶剂提取物对细胞外基质成分的影响，从中筛选出逆转肝纤维化活性最佳的部位。再利用Western blot检测最佳活性部位处理细胞后磷酸化c‑jun氨基端激酶和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶的含量；流式细胞术检测细胞凋亡率；GC‑MS方法检测活性部位的化学成分。使用本发明的方法可以快速准确地筛选出厚叶南五味子逆转肝纤维化的活性部位并检测出活性部位的化学成分。

主权项

1.厚叶南五味子逆转肝纤维化活性部位体外筛选的方法，其特征在于，所述体外筛选过程包括以下步骤：（1）厚叶南五味子提取物的制备：1）将干燥厚叶南五味子药材粉碎，用体积浓度为60‑80%的乙醇加热回流提取3次，提取液减压浓缩，回收溶剂至浸膏，加适量水混悬；2）将上述所得物根据极性依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水层；3）将各萃取液及水层分别用旋转蒸发仪回收溶剂，挥干，真空干燥，得到厚叶南五味子的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位，称重备用；（2）采用CCK‑8法检测厚叶南五味子的不同溶剂提取物对大鼠肝星状细胞HSC‑T6的增殖作用：1)取对数生长期的HSC‑T6细胞，调整细胞数为5×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，培养24h；2) 只加培养液设立空白对照组，加含0.5%DMSO的培养液作为溶剂对照组，设置不同浓度提取部位组：石油醚部位浓度为：10、20、30、40、50μg/mL，乙酸乙酯部位浓度为：40、80、120、160、200μg/mL，正丁醇和水部位的浓度均为：100、200、400、500、600μg/mL；3）每个浓度设4个复孔，继续孵育24h，每孔加入10μL CCK‑8溶液，继续孵育2h；4）用酶标仪在450nm处测定各孔吸光度OD值，计算抑制率及半数抑制浓度IC50，抑制率的计算公式：抑制率 =1‑（实验组OD值／对照组OD值) ×100%；半数抑制浓度IC50由电脑根据图像相关数据计算得到；5）确定各部位对HSC‑T6X细胞的抑制率等于20%时对应的浓度；（3）采用ELISA法检测不同溶剂提取物对细胞外基质成分的影响：1）取对数生长期的HSC‑T6细胞按2×105接种于24孔板中，培养24h；2）加入含不同浓度提取部位的培养基预处理4h；其不同浓度提取部位是在小于上述抑制率小于20%所对应的浓度下，每个提取部位分别设定3‑5个浓度值；3）各加入200μmol/L乙醛继续培养72h；4）收集培养上清液，采用ELISA试剂盒方法检测大鼠型胶原、型前胶原氨基端肽、型胶原的含量。