[发明专利]石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因bamA含量的测定方法

摘要

本发明公开了一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因bamA含量的测定方法,方法以石油污染厌氧环境中烷烃、苯系物为目标降解组分，采用非培养的分子生物学技术实时荧光定量PCR对两种降解基因进行定量。方法主要包括DNA的提取，设计特异性扩增两种降解基因的简并引物，确定PCR条件，制作荧光定量PCR标准曲线，样品测定。本发明所述方法是一种能够检测厌氧条件下微生物降解石油烃活性的新型方法，同时能准确反映微生物的降解代谢途径和区域石油污染状况，在环境污染监测和治理方面有重要的应用价值。

主权项

1.一种石油污染厌氧环境中石油烃厌氧降解基因含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)获得能在厌氧环境中降解石油烃菌株的降解基因的DNA序列，根据降解基因的DNA序列利用Primer express软件遵循引物设计原则，设计出降解基因的简并性扩增引物的序列并合成该简并性扩增引物，其中，所述降解石油烃菌株的降解基因为bamA；/n2)取得含有步骤1)中降解基因的阳性样品，提取所述阳性样品中所有微生物的DNA；通过PCR仪利用步骤1)所得简并性扩增引物以所述微生物的DNA作为DNA模板进行降解基因的PCR扩增，得到扩增产物；/n3)将步骤2)所得扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测是否得到特异性条带，如得到特异性条带，则进行切胶回收，再将特异性条带导入感受态细胞，将感受态细胞接种到LB液态培养基中培养，将培养后的感受态细胞接种到LB固态培养基平板上培养，然后进行蓝白斑阳性克隆子的筛选，通过挑选得到含有重组质粒的白色单菌落，将白色单菌落接种到LB液态培养基中培养，得到菌液；/n4)对步骤3)所得菌液的特异性条带进行测序，判断测序结果是否为步骤1)所得降解基因的序列，如测序结果为步骤1)中的降解基因的序列，则将步骤3)所得菌液提取重组质粒；/n5)使用微量核酸蛋白质分析仪测定降解基因的重组质粒的浓度X，通过公式(1)计算得到每微升重组质粒中降解石油烃菌株的降解基因的拷贝数CN，/nCN＝[(X/(T