[发明专利]一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法

摘要

本发明提供一种耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，其特征在于包括以下步骤:皮肤组织采集；组织复苏及酶解；细胞原代培养，细胞纯化；成纤维细胞扩增培养；成纤维细胞检测；成纤维细胞冻存；通过本发明所制备的成纤维细胞其活性更高、纯度更高，可用于制备高疗效的组织工程产品及美容产品。

主权项

1.一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法，包括以下步骤(1)组织采集：无菌条件下取耳后皮肤组织，置入含DMEM培养液的培养皿中,组织样本经两次DMEM和磷酸盐缓冲液离心清洗后，加入冻存液，冷冻保存；(2)组织复苏及酶解：取出冻存组织，经水浴锅中快速解冻后用75％乙醇消毒1‑3min；随后用DMEM和磷酸盐缓冲液清洗1‑3次；清洗后的皮肤组织加入中性裂解酶过夜消化后，去除表皮，用无菌剪刀将真皮组织剪碎成小块；(3)原代培养：将步骤⑵中剪碎后的皮肤组织加入的成纤维细胞专用培养液，混匀后移至培养瓶内，在含有5％CO2，37℃的培养箱中培养10‑15天；(4)细胞纯化：当步骤⑶中细胞融合度达到50％‑90％时，用含有0.25％胰蛋白酶‑EDTA消化后移至培养瓶中培养3‑5天，当细胞融合度达到90％以上时，消化收获细胞，此时为第一代细胞；将第一代细胞移至培养瓶中培养2‑3天后，消化收获细胞，此时为纯的成纤维第二代细胞；(5)成纤维细胞扩增培养：将第二代细胞接种到自动细胞扩增体系培养，每天检测自动细胞扩增系统内培养液乳酸值，并用以计算扩增的理论数值,当细胞数值达理想状态时消化收获细胞，此为第三代成纤维细胞。